分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)流程及相關(guān)第1頁(yè)/共33頁(yè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)概述生物樣品（細(xì)胞、組織、細(xì)菌）細(xì)胞調(diào)節(jié)神經(jīng)科學(xué)分子診斷DNA分離RNA分離質(zhì)粒DNA噬菌體DNA基因組DNA總RNAmRNAcDNA重組DNAPCR遺傳鑒定DNA測(cè)序DNA標(biāo)記突變基因表達(dá)第2頁(yè)/共33頁(yè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)概述（續(xù)）基因表達(dá)報(bào)告基因載體基因轉(zhuǎn)化報(bào)告基因檢測(cè)真核轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白蛋白分析蛋白分離第3頁(yè)/共33頁(yè)分子生物學(xué)主要實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)起始材料的選取和準(zhǔn)備mRNA的提取、純化目標(biāo)片段的克隆和分析DNA、RNA的提取、純化和分析克隆化基因的表達(dá)及表達(dá)蛋白的純化和功能分析基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)及轉(zhuǎn)基因結(jié)果分析第4頁(yè)/共33頁(yè)實(shí)驗(yàn)起始材料的選取和準(zhǔn)備常規(guī)材料組織器官原生質(zhì)體\細(xì)胞細(xì)菌\真菌\酵母特殊材料少量起始材料特殊病變組織亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)第5頁(yè)/共33頁(yè)實(shí)驗(yàn)起始材料的選取和準(zhǔn)備水稻卵細(xì)胞的分離分離準(zhǔn)備工作材料的速凍長(zhǎng)期保存人工氣候箱、制冰機(jī)超凈工作臺(tái)、顯微操作系統(tǒng)RNase-free耗材、液氮罐超低溫冰箱RNase抑制劑第6頁(yè)/共33頁(yè)卵細(xì)胞mRNA的提取、純化Oligotex系列試劑盒細(xì)胞裂解勻漿去蛋白和細(xì)胞殘?jiān)鼫卦〔⒔Y(jié)合洗脫去鹽和回收旋渦混勻器離心機(jī)恒溫水浴鍋離心機(jī)、旋渦混勻器200℃烘箱DEPC、RNase-freeDNaseI、RNase-free耗材第7頁(yè)/共33頁(yè)目標(biāo)片段的克隆和分析利用SMARTcDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒構(gòu)建水稻卵細(xì)胞cDNA文庫(kù)目標(biāo)基因的獲得通過(guò)噬菌體載體自切割或T-Vector、平末端載體克隆獲得目標(biāo)質(zhì)粒利用測(cè)序儀和通用引物對(duì)克隆的目的基因測(cè)序第8頁(yè)/共33頁(yè)通過(guò)SMART技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫(kù)第一鏈的合成第二鏈的合成和擴(kuò)增

酶切、純化和片段分離cDNA檢測(cè)插入載體并包裝文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)文庫(kù)擴(kuò)增及保藏恒溫水浴鍋、制冰機(jī)RTase、RNase抑制劑PCR儀高保真Taq酶恒溫水浴鍋、離心機(jī)限制性內(nèi)切酶、過(guò)濾柱電泳儀器、凝膠成像系統(tǒng)瓊脂糖恒溫水浴鍋超凈工作臺(tái)、烘箱、PCR儀培養(yǎng)基超低溫冰箱DMSO第9頁(yè)/共33頁(yè)目標(biāo)基因的克隆利用特異探針，通過(guò)核酸雜交的方法或利用特異的抗體，通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)進(jìn)行文庫(kù)目標(biāo)基因的篩選利用GSP（基因特異引物）通過(guò)PCR擴(kuò)增出目標(biāo)基因通過(guò)5‘RACE和3’RACE克隆已知部分序列的目標(biāo)基因第10頁(yè)/共33頁(yè)通過(guò)核酸雜交和免疫反應(yīng)篩庫(kù)將培養(yǎng)于平板的噬菌斑通過(guò)印跡轉(zhuǎn)于尼龍膜，并于核酸交聯(lián)儀中固定。在雜交箱中利用特定探針雜交。最后在恒溫?fù)u床中洗膜（探針標(biāo)記：放射性和非放射性）將噬菌體培養(yǎng)于平板，于42℃培養(yǎng)幾小時(shí)后，于37℃用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)并印記于尼龍膜上，利用抗原-抗體反應(yīng)進(jìn)行雜交第11頁(yè)/共33頁(yè)利用PCR技術(shù)獲得目標(biāo)基因利用GSP，以文庫(kù)為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增出目標(biāo)基因，并通過(guò)電泳、凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)利用文庫(kù)載體序列和已知的目標(biāo)基因的序列設(shè)計(jì)通用引物和GSP，通過(guò)5’RACE和3’RACE擴(kuò)增出目標(biāo)基因的5’和3’端序列。并通過(guò)電泳、凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)第12頁(yè)/共33頁(yè)DNA、RNA的提取、純化和分析包含有目標(biāo)基因的質(zhì)粒的獲得水稻基因組DNA的提取、純化和分析水稻各器官TotalRNA的提取、純化和分析第13頁(yè)/共33頁(yè)包含有目標(biāo)基因的質(zhì)粒的獲得對(duì)于通過(guò)篩庫(kù)技術(shù)獲得的目標(biāo)基因通過(guò)噬菌體載體的自切割作用生成目標(biāo)質(zhì)粒對(duì)于通過(guò)PCR技術(shù)獲得的目標(biāo)基因通過(guò)回收純化后利用T載體等克隆并轉(zhuǎn)化細(xì)菌鋪板培養(yǎng)后通過(guò)藍(lán)白斑，原位裂解雜交分離出含有目標(biāo)質(zhì)粒的單個(gè)菌落第14頁(yè)/共33頁(yè)對(duì)于通過(guò)PCR技術(shù)獲得的目標(biāo)基因PCR或RACE電泳凝膠成像系統(tǒng)長(zhǎng)波紫外觀察箱切膠膠回收試劑盒T載體、平末端載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌并鋪板培養(yǎng)篩選目標(biāo)菌落提取目標(biāo)質(zhì)粒第15頁(yè)/共33頁(yè)對(duì)于通過(guò)PCR技術(shù)獲得的目標(biāo)基因PCR或RACE瓊脂水平電泳凝膠成像系統(tǒng)、手提紫外燈長(zhǎng)波紫外觀察箱PCR回收試劑盒膠回收試劑盒PCR儀電泳儀器恒溫水浴鍋、離心機(jī)Taq酶、薄壁管、礦物油瓊脂糖第16頁(yè)/共33頁(yè)對(duì)于通過(guò)PCR技術(shù)獲得的目標(biāo)基因（續(xù)）純化產(chǎn)物PCR產(chǎn)物測(cè)序T載體、平末端載體連接細(xì)菌轉(zhuǎn)化、鋪板培養(yǎng)藍(lán)白斑篩選、菌落原位雜交質(zhì)粒提取、酶切分析、測(cè)序測(cè)序儀低溫冰箱雜交箱、恒溫?fù)u床、低溫冰箱超凈工作臺(tái)、電轉(zhuǎn)化儀離心機(jī)、恒溫水浴鍋感受態(tài)細(xì)胞、培養(yǎng)基、抗生素X-gal、IPTG、尼龍膜和探針限制性內(nèi)切酶第17頁(yè)/共33頁(yè)質(zhì)粒提取、分析常規(guī)質(zhì)粒提取方法：通過(guò)細(xì)菌的適當(dāng)裂解釋放出質(zhì)粒，利用酚和氯仿抽提掉蛋白，再利用無(wú)水乙醇沉淀質(zhì)粒DNA質(zhì)粒提取試劑盒：裂解方法一致。裂解完成后利用過(guò)濾柱純化出質(zhì)粒DNA質(zhì)粒提取后，根據(jù)以后實(shí)驗(yàn)要求利用不同的限制性內(nèi)切酶在水浴鍋中進(jìn)行酶切電泳，用凝膠成像系統(tǒng)分析測(cè)序第18頁(yè)/共33頁(yè)水稻基因組DNA的提取、

純化和分析利用SDS法或Qiagen提供的基因組提取試劑盒提取水稻基因組DNA：利用SDS在高鉀離子濃度的情況下能沉淀蛋白和多糖等雜質(zhì)的原理提取基因組DNA利用酚-氯仿抽提或過(guò)濾柱純化基因組DNA水稻基因組文庫(kù)的構(gòu)建利用特異的探針，通過(guò)Southernblotting檢測(cè)目標(biāo)基因的拷貝數(shù)第19頁(yè)/共33頁(yè)水稻各器官TotalRNA的提取、純化和分析分離所需的水稻各器官組織，并利用Qiagen的RNeasy系列試劑盒提取總RNA：將材料裂解后，通過(guò)過(guò)濾柱純化出總RNA在RNase-free的情況下，通過(guò)甲醛變性膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量利用特異性的探針，通過(guò)Northernblotting檢測(cè)目標(biāo)基因在各器官的表達(dá)情況第20頁(yè)/共33頁(yè)Southernblotting和NorthernblottingSouthernblotting基因組DNA完全消化探針制備瓊脂水平電泳比活性測(cè)定印跡轉(zhuǎn)膜DNA交聯(lián)限制性內(nèi)切酶、恒溫水浴鍋手提紫外燈、電泳儀器真空轉(zhuǎn)膜儀紫外交聯(lián)儀同位素檢測(cè)儀探針制備試劑盒尼龍膜第21頁(yè)/共33頁(yè)Southernblotting和Northernblotting（續(xù)）制備好的尼龍膜探針（放射性或非放射性）雜交雜交箱放射自顯影熒光同位素檢測(cè)儀磷屏成像系統(tǒng)熒光掃描成像系統(tǒng)第22頁(yè)/共33頁(yè)克隆化基因的表達(dá)及表達(dá)蛋白的純化和功能分析

克隆化基因的表達(dá)表達(dá)蛋白的純化

功能分析第23頁(yè)/共33頁(yè)克隆化基因的表達(dá)基因的克?。豪酶弑Ｕ娴腡aq酶和合適的反應(yīng)系統(tǒng)，通過(guò)PCR獲得與目標(biāo)基因完全一致的DNA片段（通過(guò)測(cè)序確證）體內(nèi)表達(dá)：選擇合適的表達(dá)載體插入目標(biāo)片段。利用化學(xué)方法或電轉(zhuǎn)化儀等手段轉(zhuǎn)入細(xì)胞表達(dá)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)：兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物、小麥胚芽提取物等第24頁(yè)/共33頁(yè)表達(dá)蛋白的純化SDS聚丙烯酰胺膠回收：利用SDS聚丙烯酰胺膠分離不同大小的的蛋白。利用6×HIS、GST（谷胱甘肽）等和親和樹(shù)脂純化：通過(guò)表達(dá)目標(biāo)基因的融合蛋白，利用親和層析洗脫出目標(biāo)蛋白自動(dòng)核酸/蛋白純化工作站第25頁(yè)/共33頁(yè)目標(biāo)蛋白功能分析抗體的制備：多抗、單抗DNA-蛋白質(zhì)相互作用研究：Gel-shift實(shí)驗(yàn)、蛋白質(zhì)磷酸化分析、酵母單雜交系統(tǒng)等蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究：酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體表面展示技術(shù)等第26頁(yè)/共33頁(yè)蛋白體內(nèi)表達(dá)研究Westernblotting：利用抗原-抗體反應(yīng)，對(duì)蛋白質(zhì)混合物中的目標(biāo)蛋白進(jìn)行鑒別和定量免疫組織化學(xué)研究：通過(guò)切片技術(shù)和免疫反應(yīng)，利用特異抗體檢測(cè)特定蛋白在組織細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)第27頁(yè)/共33頁(yè)基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因結(jié)果分析轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建：載體、農(nóng)桿菌、特殊抗生素植株的轉(zhuǎn)化：葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法、基因槍植株的篩選：熒光檢測(cè)、GUS染色、PCR法基因功能分析：激光共聚焦顯微鏡、FISH等第28頁(yè)/共33頁(yè)部分分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)必需儀器

純水儀移液器

pH計(jì)電子天平生化培養(yǎng)箱滅菌鍋第29頁(yè)/共33頁(yè)謝謝第30頁(yè)/共33頁(yè)人有了知識(shí)，就會(huì)具備各種分析能力