關于分離純化的后期步驟第1頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三11.1樣品的濃縮生物大分子在制備過程中由于過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：

1、減壓加溫蒸發濃縮

2、空氣流動蒸發濃縮3、冰凍法4、吸收法5、超濾法6、其他第2頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三1、減壓加溫蒸發濃縮

通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。第3頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三2、空氣流動蒸發濃縮空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置于冷室，用電扇對準吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適于大量溶液的濃縮。第4頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三3、冰凍法生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮于液面，蛋白質和酶則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。第5頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三4、吸收法通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里，外加聚乙二醇復蓋置于4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達到所需要的體積。

第6頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三5、超濾法超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發展起來的新方法，最適于生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點。第7頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三6、吹干濃縮法

將蛋白溶液裝入透析袋內，放在電風扇下吹。此法簡單，但速度慢，且溫度不能過高，最好不要超過15℃。第8頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三7、凝膠濃縮法

選用孔徑較小的凝膠，如SephadexG25或G50，將凝膠直接加入蛋白溶液中。根據干膠的吸水量和蛋白液需濃縮的倍數而稱取所需的干膠量。放入冰箱內，凝膠粒子吸水后，通過離心除去。濃縮后，蛋白質的回收率可達80％～90％。比濃縮膠應用方便，直接加入被濃縮的溶液中即可。必須注意，濃縮溶液的pH值應大于被濃縮物質的等電點，否則在濃縮膠表面產生陽離子交換，影響濃縮物質的回收率。第9頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三11.2干燥生物大分子制備得到產品，為防止變質，易于保存，常需要干燥處理，最常用的方法是冷凍干燥和真空干燥。真空干燥適用于不耐高溫，易于氧化物質的干燥和保存，整個裝置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同時增加了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時一般先將待干燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體，然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干后的產品具有疏松、溶解度好、保持天然結構等優點，適用于各類生物大分子的干燥保存。第10頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三11.3結晶結晶對酶的重要意義作為純化的方法之一作為均勻性的證據作為穩定的貯存方法單晶可以作為X-衍射分析的材料常用的結晶方法等電點結晶法鹽析結晶法透析結晶法溫差結晶法第11頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三第12頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三11.4貯存生物大分子的穩定性與保存方法的很大關系。干燥的制品一般比較穩定，在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無明顯變化，貯藏要求簡單，只要將干燥的樣品置于干燥器內（內裝有干燥劑）密封，保持0－4度冰箱即可，液態貯藏時應注意以下幾點。第13頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。

2、一般需加入防腐劑和穩定劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質和酶常用的穩定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標準緩沖液中。

3、貯藏溫度要求低，大多數在0度左右冰箱保存，有的則要求更低，應視不同物質而定。第14頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三11.5純度鑒定電泳法沉降法分光光度法：A280/260=1.75恒溶解度法結晶法：免疫法第15頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三11.6蛋白質分子量的測定方法1.沉降離心法：M=RTS/D（1-）2.滲透壓法：M=gRT/PC3.電泳法：lgM=a－bRf4.分子篩法：lgM=a－bVe5.最小分子量法：蛋白質最小分子量＝100*金屬原子量／該金屬在該蛋白質中的百分含量第16頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三11.7蛋白質（酶）含量的測定方法凱氏(Kjedahl)定氮法雙縮脲反應紫外光分光度法染料結合法之一水揚酸比色法Folin試劑法（Lowry法）第17頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三11.8分離純化步驟的設計與方法的選擇原則純化步驟的評價第18頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三第19頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三原則（1）明確分離純化的目的(2)所分離的物質的性質（3）原料的特性與數量（4）時間（5）實驗條件（6）各種方法的原理特性和優缺點（7）各種方法的使用順序安排要合理（8）快速穩定的活力與含量的測定方法（9）操作過程中各種因素的影響第20頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三第21頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三蛋白純化的基本策略捕獲階段：目標是澄清、濃縮和穩定目標蛋白。

中度純化階段：目標是除去大多數大量雜質，如其它蛋白、核酸、內毒素和病毒等。

精制階段：除去殘余的痕量雜質和必須去除的雜質。第22頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三第23頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三分離方法的選擇根據蛋白質的特殊性質采用不同的分離方法第24頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三根據溶解度不同的分離方法等電點沉淀法、鹽析法、有機溶劑沉淀法、PEG沉淀法根據分子大小不同的分離方法透析/超過濾、分子篩、離心法根據分子帶電性不同的分離方法離子交換層析、電泳法根據分子吸附性不同的分離方法吸附層析、親和層析第25頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三第26頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三蛋白質的性質方法電荷（等電點）離子交換（IEX）分子量凝膠過濾（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特異性結合親和（AC）第27頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三每一種方法都有分辨率、處理量、速度和回收率之間的平衡分辨率：由選擇的方法和層析介質生成窄峰的能力來實現。總的來說，當雜質和目標蛋白性質相似時，在純化的最后階段分辨率是重要因素。

處理量：一般指在純化過程中目標蛋白的上樣量。如上樣體積、濃度等。

速度：在初純化中是重要因素，此時雜質如蛋白酶必須盡快除去。

回收率：隨著純化的進行漸趨重要，因為純化產物的價值在增加。第28頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三技術主要特點捕獲中度純化精制樣品起始狀態樣品最終狀態IEX高分辨率高容量高速度★★★★★★★★★低離子強度樣品體積不限高離子強度或pH改變。樣品濃縮HIC分辨率好容量好高速度★★★★★★高離子強度樣品體積不限低離子強度樣品濃縮AC高分辨率高容量高速度★★★★★★★★結合條件特殊樣品體積不限洗脫條件特殊樣品濃縮GF高分辨率（使用Supedex）

★★★★樣品體積（<總柱體積的5%）和流速范圍有限制緩沖液更換（如果需要）樣品稀釋RPC高分辨率

★★★★需要有機溶劑在有機溶劑中，有損失生物活性的風險在三階段純化策略中每一種方法的適用性

第29頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三第30頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三第31頁，共35頁，2023年，2月20日，星期三提示：1、

通過組和各種方法使純化步驟之間的樣品處理減至最少，以避免需要調節樣品。第一個步驟的產物的洗脫條件應適宜于下一個步驟的起始條件。2、

硫酸銨沉淀是常用的樣品澄清和濃縮方法，所以HIC是捕獲階段的理想方法。3、

GF很適宜在由濃縮效應的方法（IEX、HIC、AC）后使用，凝膠過濾對上樣體積有限制，但不受緩沖液條件的影響。4、

在捕獲階段選擇對目標蛋白