絲狀真菌遺傳第1頁/共69頁

第二節

構巢曲霉(非順序排列四分體)的遺傳分析在構巢曲霉(A.nidulans)中，一次減數分裂的全部產物雖然也同處于一個子囊內，但是其子囊孢子不象粗糙脈孢菌那樣呈直線排列，而是無順序的排列。我們將這種不是以直線方式排列在一個子囊內的四個減數分裂產物稱為非順序排列四分體。一、構巢曲霉的生活史構巢曲霉的有性生殖是通過同宗接合的方式進行的，其生活史見圖。

第2頁/共69頁第3頁/共69頁二、構巢曲霉有性雜交的遺傳分析構巢曲霉有性雜交產生的是非順序排列的四分體，無法判斷它們是屬于第一次分裂分離還是第二次分裂分離，因此在粗糙脈孢菌中適用的通過第二次分離子囊數來計算著絲粒距離的方法，在構巢曲霉有性雜交中不適用。但把四分體歸納為PD、NPD何T三種類型時，是以四分體中子囊孢子性狀的組合方式劃分的，沒有考慮四分體中孢子的排列順序。所以在構巢曲霉有性雜交中可采用四分體中PD、NPD和T的出現頻率來進行遺傳分析。另外，也可用隨機孢子分析法來進行分析。Pontecorvo等人將pabyBIO與PABYbio株雜交，隨機地挑取2個子囊果，來檢查重組型的出現情況，其結果如表所示。第4頁/共69頁

表pabyBIO×PABYbio雜交結果雜交pabyBIO_____________________ab_______________________PABYbio

基因型ⅠⅡ總計交換部位

pabyBIO144117261―PABYbio156125281―pabYbio422062aPAByBIO392463apabybio11516bPABYBIO102232bpabYBIO011a，bPABybio235a，b

第5頁/共69頁

Ⅰ和Ⅱ為所檢測到的子囊果號；pab為對氨基苯甲酸；y為黃色突變株；bio為生物素第6頁/共69頁根據：

重組染色單體數目2T+4NPD

重組頻率=______________________________×100%=__________________________×100%

染色單體總數目4(T+PD+NPD)

由表所示結果，計算如下：

62+63+1+5pab-y重組率=______________________________________________________×100%=18.2%261+281+62+63+16+32+1+5

16+32+1+5y-bio重組率=______________________________________________________×100%=7.5%261+281+62+63+16+32+1+5

62+63+16+32pab-bio重組率=______________________________________________________×100%=24%261+281+62+63+16+32+1+5

第7頁/共69頁因此，供試的三個基因在染色體上的排列為：

_____pab_______________y_________bio__________

第8頁/共69頁第三節

真菌的準性生殖(parasexualcycle)

如前所述，真菌在進行有性循環時，通過減數分裂可產生重組體，是實現基因重組的一條重要途徑。但是有很多真菌，特別是半知菌亞門的真菌，沒有或很少發生有性生殖過程，卻仍然表現出了較高頻率的變異，這種變異就是通過另一條獨立于有性生殖的基因重組途徑_____

準性生殖。準性生殖是真菌的一種導致基因重組的過程，包括異核體的形成、二倍體的形成以及體細胞交換和單元化。一、準性生殖的普遍性在20世紀50年代初，科學家在對構巢曲霉的研究中，發現了準性生殖。后來，各國的研究者先后在21個屬、40個真菌中證實了準性生殖過程的發生(表)。第9頁/共69頁

表已知發生準性生殖的真菌粘菌綱(Acrasiomycetes)擔子菌綱(Basidiomycetes)Dicrysteliumdiscoideum

黑粉菌屬(3個種)(Ustilago)

柄銹菌屬(3個種)(Puccinia)

藻狀菌綱(Phycomycetes)亞麻珊銹菌(Melampsoralini)

布拉克須霉(Phycomycesblakesleeanus)鬼傘屬(4個種)(Coprinus)

裂褶菌(Schizophyllumcommune)

子囊菌綱(Ascomycetes)

曲霉屬(9個種)(Aspergillus)半知菌綱(Deuteromycetes)

青霉屬(3個種)(Penicillum)尖鐮孢菌(Fusariumoxysporum)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)輪子孢屬(2個種)(Verticillium)栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)頭孢霉屬(2個種)(Cephalosporium)

禾旋孢腔菌(Cochliobolussativus)腐質霉(Humicolasp.)

小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)不全殼二孢屬(Ascochyraimperfect)

柄孢殼菌(Podosporaanserina)Pyriculariaoryzae

粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)

第10頁/共69頁二、準性生殖的過程

準性生殖過程包括異核體的形成、體細胞二倍體的產生以及體細胞中染色體的交換和單倍化。下面就這三個階段分別進行討論。(一)異核體的形成當帶有不同遺傳性狀的兩個單倍體細胞或菌絲相互融合時，會導致在一個細胞或菌絲中并存有兩種或兩種以上不同遺傳型的細胞核，這樣的細胞或菌絲就叫異核體。異核體的形成是進行準性生殖的第一步。由于準性生殖首先是在構巢曲霉中發現的，所以下面以構巢曲霉為例來說明。第11頁/共69頁

當把構巢曲霉A接合型的亮氨酸缺陷突變株(leu–met+)與A接合型的蛋氨酸缺陷型突變株(leu+met-)混合接種在基本培養基上培養時，常常可以產生少量原養型菌落，這些菌落是異核體。這是因為兩個親本的菌絲間發生相互聯結，形成了細胞質和細胞核相互混雜的異核體。在異核體中兩種細胞核能彼此提供所缺少的酶，因此可不需亮氨酸和蛋氨酸而在基本培養基上生長。第12頁/共69頁1．異核體的證實我們知道，將兩個營養缺陷型菌株混合培養，出現原養型菌落的原因可能是由于互養、異核體、二倍體或單倍重組體的存在。如何證明上述情況是由于異核體所致呢？(1)互養這一解釋的排除為了排除互養的存在，人們將原養型菌落上取下的少量菌絲接種于養料貧乏的培養基上。在放大鏡下將從接種處向外長出的菌絲的尖端連同小塊培養基切下，放在基本培養基上。如果原養型菌落的出現是由于互養所致，那么單個菌絲尖端就不會生長。可是只要割取的菌絲尖端不是太短而妨礙生長，往往可以得到一個新的培養物，因此可以排除互養這一解釋。第13頁/共69頁(2)二倍體或單倍體的排除為了排除二倍體和單倍重組體的存在，可將leu–met+株和leu+met–株的分生孢子混合接種在基本培養基上，取出其上長出的菌落的單個菌絲尖端，接種于基本培養基上，得到由單個菌絲尖端所長成的培養物。收集該培養物上的孢子，分別接種于基本培養基、含亮氨酸培養基和含蛋氨酸培養基上，經培養發現在前一種培養基上沒有菌落，而在后兩種培養基上可出現菌落由于構巢曲霉的分生孢子是單核的，所以由異核體產生的分生孢子的核型應分屬于leu–met+株或leu+met–，所以它們在基本培養基上不生長，而能在后兩種培養基上生長。而二倍體(leu–met+/leu+met–)和重組單倍體(leu+met+)能在基本培養基上生長，而實驗結果與此相反，所以上述原養型菌落的出現并非二倍體和單倍重組體所致。從而說明了上述原養型菌落確實是異核體。第14頁/共69頁2．異核體的生物學意義異核現象在自然界普遍存在。早在1938年就已在35屬的半知菌中發現32屬有異核現象。異核現象在自然界這樣普遍的一個原因是異核體包含著不同基因型的細胞核，具有生長優勢，另外是具有更好的環境適應能力。此外，異核體在遺傳分析中也很重要，由于異核體內的兩個不同營養缺陷型的細胞具有互補作用，因此可以用異核體進行基因等位性的測定等研究。一般地說，異核體的形成與A、a接合型之間沒有關系，但接合型可影響形成異核體的難易程度，相同接合型的菌株間更容易形成異核體。異核體的形成是由基因型決定的，在粗糙脈孢菌中已發現至少有10個基因與異核體的形成有關。

第15頁/共69頁(二)雜合二倍體的形成異核體細胞中存在著核融合的可能。核融合是指兩個單倍體核融合形成一個二倍體核的現象。基因型相同的核融合形成純合二倍體，基因型不同的核融合形成雜合二倍體。異核體中兩個基因型不同的細胞核可以以極低的頻率融合成雜合二倍體。研究表明異核體發生核融合而產生二倍體的頻率為10-7—10-5。用某些理化因素(如紫外線、樟腦蒸氣或高溫)處理，可提高二倍體產生的頻率。原因可能是由于在處理過程中使某些抑制核融合的基因發生突變的結果。如果把大量的異核體所產生的分生孢子菌株在基本培養基上，就可以得到少數菌落。這些菌落不同于第一次混合接種leu-met+

株和leu+met-株的孢子在基本培養基上所出現的原養型菌落，因為從現在得到的少數菌落上取得的分生孢子都能在基本培養基上形成菌落。可見這些菌株是二倍體菌株而不是異核體。下面以構巢曲霉為例，來介紹二倍體的特征。第16頁/共69頁1956年，Pontecorvo等人在用構巢曲霉白色突變株(w-y+)和黃色突變株(w+y-)進行異核體的研究時發現，在培養基中可產生形成綠色孢子的菌株。根據前面談到的有關內容，可知由異核體(w-y+//w+y-)所產生的孢子應該是白色和黃色兩種，那么綠色的孢子是怎樣形成的呢？經研究發現該綠色的分生孢子并不穩定，在使之形成大菌落時，常常會以很低的頻率出現白色或黃色的扇形面-----角變。另外，形成綠色分生孢子的菌株的細胞內只有一個核，且其DNA的含量為親本DNA含量的2倍。因此，人們認為綠色分生孢子的形成是由于異核體中的兩個核融合而形成二倍體(w-y+/w+y-)的緣故。由于白色突變型和黃色突變型對于綠色野生型來講都是隱性的，所以二倍體的分生孢子必然呈綠色。

第17頁/共69頁

那么二倍體有什么特性呢？由表可以看出，構巢曲霉、黑曲霉等的二倍體分生孢子大于單倍體的分生孢子；并且在醬油曲霉中，盡管分生孢子的大小是一樣的，但每個分生孢子中核的數目是不相同的,二倍體分生孢子中核數約為單倍體分生孢子的一半。

第18頁/共69頁

表幾種真菌分生孢子特性的比較單倍體分生孢子二倍體分生孢子

直徑(um)體積(um3)核數/孢子直徑(um)體積(um3)核數/孢子構巢曲霉3.1516.31.04.033.51.0

黑曲霉4.547.71.05.433.51.0

醬油曲霉―135.04.22―128.02.21

米曲霉――3.5――1.9

產黃青霉3.726.91.04.961.91.0

第19頁/共69頁

根據雜合體細胞二倍體的特性，不難將它們與異核體菌落及回復突變產生的原養型菌落區別開來。一般通過測定培養特征、穩定性、分生孢子核型、分生孢子大小及DNA含量和采用雙標記菌株實驗，即刻排除異核體、單倍體和回復突變。第20頁/共69頁(三)

體細胞交換和單元化準性生殖循環過程中產生的二倍體并不象有性生殖過程中的二倍體那樣進行減數分裂，它們仍以有絲分裂的形式增殖。從穩定性來看，二倍體細胞比異核體較為穩定。從異核體所取得的分生孢子屬于兩個親本菌株，從二倍體得到的分生孢子則一律都是二倍體。可是穩定性是相對的，正像從異核體中可以得到少數二倍體犯不著一樣，從大量的二倍體分生孢子中也可以得到少數體細胞分離子。所謂分離子包括重組體和非整倍體或單倍體。產生非整倍體或單倍體的過程稱為單元化，產生重組體的過程稱為體細胞交換。第21頁/共69頁

例如，從二倍體w-y+/w+y-株中分離出分生孢子為白色和黃色的菌株，并且發現它們都具有2n的細胞核，認為它們是由于2n核在有絲分裂過程中發生了體細胞重組，從而引起了綠色→白色、綠色→黃色的變化。也就是說，二倍體w-y+/w+y-的孢子是綠色的，重組體w-y+/w-y-的的孢子是白色的，重組體w+y-/w-y-的孢子是的孢子是黃色的。那么，體細胞重組體是如何產生的呢？經研究發現，體細胞重組體的出現是由于在有絲分裂過程中同樣染色體間發生染色體交換，從而導致部分基因的純合化。如圖所示，二倍體AbCd/aBcD在有絲分裂過程中，由于同源染色體間發生交換，結果出現了AbCd/aBCd、AbcD/aBcD、AbcD/aBCd等重組體。從中可以看出，在AbCd/aBCd重組體中，C、d基因呈純合狀態；同樣在AbcD/aBcD重組體中，c、D呈純合狀態。當然，如果在進行有絲分裂過程中部發生同源染色體交換的話，二倍體AbCd/aBcD細胞的子細胞仍都是AbCd/aBcD。第22頁/共69頁第23頁/共69頁

此外，研究發現二倍體細胞在有絲分裂過程中通過產生非整倍體或單倍體---單元化過程亦可形成重組體(圖)。在正常的有絲分裂中，染色體一分為二，各自在紡錘絲的作用下趨向細胞的一極，使子細胞中各含義條染色體。由于紡錘絲斷裂或其它原因會造成染色體不分離，使分裂后的兩條染色體都趨向一極，結果是一個細胞缺少一條染色體(2n―1)，而另一細胞多了一條染色體(2n+1)，它們都是非整倍體。

2n+1非整倍體亦稱為三體，在有絲分裂過程中常會失去一條染色體而成為二倍體。經過這一過程，雜合二倍體就可以轉變成純合二倍體(圖的上部)。2n―1非整倍體亦稱為單體，在有絲分裂過程中常常會進一步失去其它的染色體而最終成為單倍體。經過這一過程，雜合二倍體就可以轉變成ABC、ABc等各種單倍體(圖的下部)。第24頁/共69頁第25頁/共69頁

根據數以千計的分離子的分析，發現在準性生殖過程中異核體產生二倍體的概率是10-6，二倍體產生單倍體的概率是10-3，二倍體核中發生體細胞交換的概率是10-2。體細胞交換和單元化是兩個獨立發生的事件，二者發生在同一細胞中的概率很小，同一染色體上發生兩次交換的概率同樣很小。綜上所述，在準性生殖過程中，體細胞交換和單元化是兩個獨立發生的。體細胞交換產生部分基因純合化的二倍體的重組體，而單元化過程則產生各種類型的非整倍體和單倍體的重組體。因此，可以通過體細胞重組和單元化過程進行有絲分裂定位。第26頁/共69頁

第四節

絲狀真菌的遺傳物質和基因表達調控

真菌的遺傳物質包括5種成份:染色體基因、線粒體基因、質粒、轉座因子及病毒基因。一、染色體和基因組結構1.染色體除過絲狀真菌基因組含有較少的(約為2～5%)重復DNA序列外，絲狀真菌的核基因組和線粒體基因組及其結構功能與高等真核生物類似。絲狀真菌單倍體通常含有6～8個線狀染色體，基因組大小平均為2×107～4×107bp。真菌的基因也含內含子，但一般較短，大約50～200bp。第27頁/共69頁

粗糙脈孢霉單倍體基因組為4.3×107bp，G+C含量為54%,每條染色體的大小為4～10.3Mb。端粒與人的端粒相同。線粒體內含有質粒。已經鑒定了2000多個不同的粗糙脈孢菌基因，目前正在構建基因組的物理圖譜，德國和美國的科學家及其單位正在進行基因組測序。第28頁/共69頁2.核基因組結構絲狀真菌中功能相關的結構基因一般是不連鎖的、分散存在于基因組中。但也有一些如與脯氨酸代謝有關的4個基因、與奎尼酸代謝有關的7個基因以及有關青霉素生物合成的3個基因是連鎖的，聚集在一起構成基因簇，前兩個基因簇同時還包含結構基因和調節基因。基因簇中所有各基因都是分別產生各自的mRNA，并不象原核生物那樣形成操縱子結構。

1989年在自然界分離的粗糙脈孢菌菌株中發現了絲狀真菌的第一個轉座子Tad，該轉座子全長7kb，在核基因組中以多拷貝存在，插入DNA時產生靶序列的重復。后來，在其它真菌如尖鐮刀菌中也發現了轉座因子，而且發現轉座子與植物病原菌的致病和培養性狀的高度變異有關。第29頁/共69頁3.線粒體基因組絲狀真菌線粒體是大小為幾十個kb的環狀結構，它含16S和23SrRNA基因和20多個tRNA基因，還有幾個與電子傳遞鏈有關的結構基因。此外，還還有一些尚未鑒定的ORF。線粒體基因組在正常復制過程中經常發生分子內重組，造成基因組大小的多變。重組的內容和方式有多種，如線粒體DNA重排、DNA片段的插入或缺失。還有因內含子剪接不同造成基因內所含內含子數目不等等。第30頁/共69頁二、基因結構(1)啟動子許多絲狀真菌基因的5’非編碼區存在高等真核生物基因啟動子中普遍具有的CAAT和TATA盒。但有許多絲狀真菌基因并不含上述保守序列。(2)上游激活序列上游激活序列是與激活蛋白結合的部位。在粗糙脈孢菌奎尼酸代謝(qa)基因簇中，qa-1F編碼的激活蛋白能與該基因簇中5個結構基因的5’非編碼區結合，并對轉錄起激活作用。第31頁/共69頁(3)增強子缺失分析發現粗糙脈孢菌的am基因(編碼谷氨酸脫氫酶)受兩個5’上游遠距離序列的調節，一個序列在轉錄起始點上游1.4kb，另一個在上游2.1～3.2kb之間。當同時缺失這兩個序列時，只保留5～16%的表達水平，推測這兩個序列可能是弱的增強子。第32頁/共69頁三、基因表達的調控隨著分子生物學研究方法在絲狀真菌研究中的應用,已經開展了對絲狀真菌基因的表達及其調控全方位的研究，并取得了一定的進展。如在抗生素生物合成的基因簇結構、基因表達調控；分生孢子形成的結構基因及其分生孢子發育過程中基因表達的時空秩序性；參與營養物質代謝的基因及其表達調控等方面已做了較深入的研究工作。下面以粗糙脈孢菌奎尼酸代謝為例，闡述其調控機制。第33頁/共69頁

粗糙脈孢菌的qa基因簇（奎尼酸代謝基因簇）粗糙脈孢菌的qa基因簇包含5個結構基因和2個調節基因，全長18kb(圖)。5個結構基因從左到右依次是:qa-X、qa-2、qa-4、qa-3和qa-Y；2個調節基因分別是qa-1F和qa-1S。這2個調節基因qa-1F和qa-1S，分別編碼激活蛋白和阻遏蛋白，在無奎尼酸時這2個基因屬于低水平的組成型表達。

5個結構基因的轉錄受奎尼酸的協同誘導，同時受qa-1F和qa-1S的協同調節，誘導時的轉錄水平比無誘導時高50～1000倍。所有qa基因簇(包括結構基因和調節基因)的轉錄都需要qa-1F編碼的蛋白的激活。無誘導物時，qa-1S編碼的阻遏蛋白與激活蛋白結合，阻止了qa-1F基因的轉錄，從而使qa結構基因及其qa-1S基因的轉錄受阻，僅維持在基礎水平的轉錄。第34頁/共69頁第35頁/共69頁

有誘導物時，誘導物與阻遏蛋白結合，使qa-1F基因脫阻遏，產生的激活蛋白促進qa結構基因的轉錄，與此同時也促進qa-1S的轉錄，因此一旦誘導物水平下降，已逐漸積累的阻遏蛋白便可立即將整個系統關閉。在qa基因簇中共有13個激活蛋白的結合部位，該部位是部分對稱的16bp的保守序列GGATAANNNNTTATCC，說明有些基因啟動子上游有1個以上的激活蛋白結合部位。第36頁/共69頁四、絲狀真菌的接合型基因已經對多數絲狀子囊菌和擔子菌的接合型基因進行了克隆和特征分析。接合型基因的名稱現在傾向于統一用MAT來表示，但對于個別舊的稱呼仍然延用。粗糙脈孢菌的接合型有A和a兩種類型,mata的長度為3235bp，含有一個ORF,即mat–a1，編碼382個氨基酸；matA的長度為5301bp，含有3個ORF，即matA-1、matA-2和mat

A-3,它們編碼的產物的氨基酸長度分別為293、373和324(圖)。mata和matA這兩個DNA區段并無同源性，但它們兩側的DNA序列是相同的。mata和matA這兩個不同的DNA區段在單倍體細胞中對應的相同的染色體上占據著相同的位置，被叫做二極性(idiomorphs)，而不叫等位基因。

mata-1和matA-1是細胞接合和有性生殖所必需的，而matA-2和matA-3能提高有性生殖能力但并不是有性生殖所必需的。第37頁/共69頁mata和matA的作用可能與釀酒酵母中的接合型基因類似，編碼調節蛋白，對接合信息素的分泌和受體的產生進行調控。其它絲狀子囊菌如Gibberella、Podospora、Pyrenoperiza、P.anserina等都有與粗糙脈孢菌類似的結構，即mata含有單一ORF而matA含有3個ORF，其作用可能也類似。但擔子菌的接合型基因的結構和作用則不同于子囊菌。在擔子菌中，接合型基因直接編碼信息素和受體，直接控制著細胞的融合和有性孢子的形成。

圖第38頁/共69頁第五節絲狀真菌的轉化及其特點一、外源DNA導入絲狀真菌受體的方法外源DNA導入絲狀真菌中最普遍使用的方法是CaCl2/PEG介導的原生質體轉化。首先是用溶壁酶處理菌絲體或萌發的孢子獲得原生質體，然后將原生質體、外源DNA混合于一定濃度的CaCl2、PEG(聚乙二醇)緩沖液中進行融合轉化，然后將原生質體涂布于再生培養基中選擇轉化子。對于難以獲得原生質體的絲狀真菌來說，也可利用醋酸鋰介導的完整細胞的轉化，但轉化率低。在絲狀真菌中也應用了電轉化技術，與普遍采用的CaCl2/PEG方法相比，雖然簡化了操作步驟，但對提高轉化率并無明顯作用。基因槍注射(或生物導彈)轉化技術，最近幾年也在絲狀真菌中得到應用，它同樣不能十分有效地提高轉化率。第39頁/共69頁二、載體及其選擇標記1.載體轉化DNA進入寄主細胞后，可獨立寄主細胞核染色體而自主復制，或整合到寄主染色體上而隨寄主染色體一起復制，前者被稱為復制型轉化，后者被稱為整合型轉化。已實現轉化的絲狀真菌中，絕大多數都是整合型轉化。早期應用的載體通常以細菌質粒如pBR322、pUC等為主，在鈣離子和PEG作用下向受體菌原生質體進行轉移，轉化效率較低，一般每微克轉化DNA產生100個以下的轉化子。這類載體引起的轉化一般屬于整合型轉化，常常載體攜帶的真菌基因和載體本身會同時整合到受體染色體上。DNA進入受體細胞后，是通過同源重組和非同源重組兩種方式而整合到受體菌的染色體上的。第40頁/共69頁

在絲狀真菌中，轉化DNA的整合不需要廣泛的序列同源性，這是絲狀真菌轉化不同于酵母菌轉化的普遍特點。同源重組產生兩種類型轉化子，一種在染色體基因組上帶有目的基因的連鎖的重復，這是載體與受體染色體DNA發生單交換第41頁/共69頁結果；另一種是基因取代，這是載體DNA與受體DNA間的雙交換。非同源重組產生多拷貝整合的轉化子,即在轉化子DNA上帶有目的基因的非連鎖的重復。在黑曲霉(A.niger)轉化中非同源重組傾向尤為顯著，經常發生多拷貝質粒的串聯整合。質粒的非同源整合實際上是發生在短的DNA序列間的同源重組。對一些轉化子中質粒DNA和基因組DNA的連接部位的了序列分析表明，只有3～7個堿基序列的同源性。復制型轉化需要構建含第42頁/共69頁復制型轉化需要構建含有真菌復制子的復制型載體，已從玉米瘤黑粉、構巢曲霉、米曲霉、脈胞霉菌等多種絲狀真菌的線粒體DNA或基因組DNA中分離到自主復制序列(ARS)。最初人們做了大量工作試圖在體外構建構巢曲霉和粗糙脈胞霉的自主復制載體，但沒有檢測到具有自主復制活性。直到1988年Tsukuda等將玉米瘤黑粉菌的ARS插入到整合型載體中才成功地構建了復制型載體，它能在瘤黑粉細胞中自主復制,并使轉化率高達10,000個/μgDNA；1991年Davis成功地構建了構巢曲霉自主復制型載體ARp1(11.5kb)。另外，還構建了許多自主復制載體，使一些絲狀真菌實現了自主復制質粒的轉化。第43頁/共69頁2.選擇標記所用的選擇標記分兩類，一類是營養互補標記，另一類是顯性標記(抗生素或藥物抗性)。最初轉化的絲狀真菌多是利用營養缺陷型菌株而進行的，通過將野生型等位基因轉移到相應的營養缺陷型菌株中，在基本培養基中篩選原養型生長菌落而得到轉化子。目前,已用于絲狀真菌轉化的野生型標記基因有ade(腺嘌呤)、met(蛋氨酸)、pyr(嘧啶)、trp(色氨酸)、nic(尼克酸)、ribo(核黃素)、arg(精氨酸)、leu(亮氨酸)、pro(脯氨酸)、niaD(硝酸還原酶)等。使用營養互補標記基因的優點是有可能引導載體質粒整合到染色體的同源部位，且轉化的本底低，易于篩選；缺點是在大多數絲狀真菌中難以獲得適宜的營養缺陷型菌株。顯性標記基因避免了上述缺點而被廣泛應用，它包括藥物抗性標記如潮霉素B抗性、卡那霉素抗性和苯菌靈抗性等，還包括提供受體新功能的標記，其中構巢曲霉的amdS基因就能使受體在以乙酰胺或丙酰胺為唯一碳源或氮源的培養基上生長。細菌來源的抗性基因在絲狀真菌啟動子的帶動下的表達可作為絲狀真菌轉化的選擇標記，如lacZ

基因和GUS基因。第44頁/共69頁三、絲狀真菌轉化子的表達及其穩定性克隆基因在轉化受體菌中的表達水平與多種因素有關，包括載體中所用啟動子及其其它調控序列的存在、目的基因整合位置、整入拷貝數和受體菌株等。一般來說，無論整合型轉化子還是復制型轉化子，其在有絲分裂過程中是穩定的，大多數轉化DNA在經過幾十代的有絲分裂后仍保持穩定性。但經過減數分裂表現出高度的不穩定，尤其是粗糙脈孢菌。經過有性過程導致轉化DNA丟失的機制有:質粒的丟失、DNA的切離、DNA重排等。第45頁/共69頁第六節絲狀真菌中的質粒質粒最初是在細菌中發現的，后來在真核生物中也發現質粒。真核生物中記載最多的是真菌中含有質粒，少數植物含有質粒，動物細胞內沒有質粒。真菌細胞中的質粒一般是環狀或線狀的雙鏈DNA分子，而且大多是不編碼任何表型性狀的隱蔽質粒，位于細胞核或線粒體內。一、絲狀真菌中的天然質粒及其分布到目前為止，已經發現很絲狀真菌中都具有質粒，絲狀真菌中的質粒有環狀和線狀兩種類型，位于真菌的線粒體內(表2-3)。第46頁/共69頁

表2-3含有質粒的真菌名稱Absidiaglauca灰色梨頭霉Agaricusspp.

傘菌Ascobolusimmerses

埋生糞盤菌Ascosphaeriaapis蜂狀囊菌Alternariaalternata鏈格孢菌Clavicepspurpurea

麥角菌Cochliobolus

旋孢腔菌Epichloetyphina香柱菌Erisyphegraminis

禾白粉菌Fusariumsolani茄腐皮鐮刀菌Fusariumoxysporum

尖孢鐮刀菌Leptosphaeriamaculans十字花科子囊腔菌Morchellaconica尖頂羊肚菌第47頁/共69頁Nectriahaematococca

赤球叢赤殼菌Neurosporacrassa

粗糙脈孢菌Neurosporaintermedia中脈孢菌Podosporaanserine四孢殼孢菌Phythiumspp.腐霉菌Rhizoctoniasolani立枯絲核菌Tilletiaspp.腥黑粉菌Tricodermaviride綠木霉

第48頁/共69頁有些絲狀真菌中質粒的命名最早是根據質粒寄主的采集地點而定的。如粗糙脈孢霉菌中的Mauriceville質粒，中脈孢菌中的Lebelle和Fiji質粒等。對脈孢霉屬的質粒概況研究表明，該屬含有11種不同的質粒，質粒具有線狀和環狀兩種類型(見表2-4)。對尖胞鐮刀菌、立枯絲核菌的研究表明，每種真菌中都含有一種或一種以上的質粒。值得注意的是，在研究最多的曲霉中尚還沒有發現質粒。

表2-4脈胞霉菌中的質粒同源組質粒類型同源組環狀Mauriceville，Fiji，LaBelle，Java，MBI，VS，Harbin-2線狀Kalilo，Maranhar，Moorea，Zhisi

第49頁/共69頁二、質粒的表型和質粒結構實際上，對所有絲狀真菌中的質粒而言，其對寄主表型的影響仍然不清楚。在大多數情況下，沒有發現對寄主真菌的生長有明顯的影響作用。也許質粒能夠賦予寄主選擇優勢，如在線粒體代謝或分裂的某些方面。另外，有些質粒與宿主真菌的老化有關。上面例舉的具有質粒的真菌很多都是寄生真菌。真菌中的天然質粒最常見的是線狀，環狀質粒主要存在于在脈胞霉菌中，其它個別種如：旋孢腔菌、麥角菌和灰綠梨頭霉中也有環狀質粒。據DNA的雙向電泳和脈沖電泳，可將線性質粒與線粒體DNA區分開。大多數線型質粒在兩條DNA鏈的5’末端各有一個共價結合的蛋白，保護DNA免受酶的降解。在真菌中，環狀質粒的檢測比較復雜，常用探針檢測線粒體部分，根據帶型來進行確定。第50頁/共69頁1.線型質粒研究最深入的是脈孢霉菌中的天然質粒，對環狀質粒和線狀質粒都進行了全序列分析研究，特征見圖。線狀質粒Kalilo和Maranhar的總體結構是目前發現的大多數其它絲狀真菌中線狀質粒的典型代表。其特點如下：(1)有末端反向重復序列(TIR)，其長度因每種質粒而異；(2)在質粒的兩個5’末端各有一個結合蛋白，保護質粒不受核酸外切酶的破壞；(3)有兩個非重疊的ORF，每個ORF都起始于末端反向重復序列內，但轉錄方向相反，即轉錄方向都是從末端指向中央。其中一個ORF編碼DNA聚合酶，另一個編碼RNA聚合酶，它們與噬菌體和酵母線粒體中的多聚酶具有相似性。在兩個ORF之間有基因間隔區，雖然含有轉錄信號，但尚未發現有什么功能。大多數真菌的線狀質粒有兩個類似的ORF，但有些只有一個ORF。不同的質粒，其ORF的排列可能也不同。第51頁/共69頁第52頁/共69頁立枯絲核菌中的3個線狀質粒在幾方面表現出非典型性，首先它們的末端似乎是閉合的發夾結構，其次是ORF都不大于91個氨基酸。

第53頁/共69頁2.環狀質粒脈孢菌屬中的環狀質粒也不具有抗性特征。Fiji和LaBelle這兩種環狀質粒編碼DNA聚合酶；Mauriceville和Varkud這兩種環狀質粒編碼反轉錄酶(reversetranscriptase)。脈孢菌屬中的環狀質粒都產生全長的RNA轉錄物,特別是在Mauriceville和Varkud質粒中。VS質粒只存在于含有Varkud質粒的真菌菌株中，自己本身沒有編碼蛋白質的ORF，可能依賴于Varkud質粒提供的功能，但確在體內發現VS的轉錄物。第54頁/共69頁三、質粒的遺傳一般線粒體質粒的遺傳與線粒體和線粒體DNA(mtDNA)有相同的遺傳方式。在有性雜交中，母本的質粒絕大多數或全部地傳遞給子代，一個例外是四孢殼孢菌AL2菌株中的pAL2-1質粒，當AL2在雜交中作為母本時，有些后代不含質粒。實驗室內的研究表明,在種內和種間存在著水平轉移。粗糙脈孢霉菌中的Kalilo和Maranhar質粒能通過異核現象在菌株間進行水平轉移。另外，中脈孢霉菌和粗糙脈孢霉菌混合培養時，前者的Kalilo質粒能夠進入粗糙脈孢霉菌不含質粒的菌株中，一定是通過部分或瞬間異核體。在麥角菌中，天然質粒通過原生質融合能從一個菌株轉移到另一個菌株中。研究也發現Kalilo質粒存在于脈孢菌和Gelasinosporaspecies中，可能是種間轉移的結果，也可能是來自相同的祖先。第55頁/共69頁四、質粒整合到mtDNA

中脈孢霉菌的Kalilo質粒和粗糙脈孢霉菌中的Mauriceville質粒能整合到線粒體DNA上，引起寄主菌株的衰老和死亡。大多數野生型菌株并衰老，而是在長的生長管中繼續生長。衰老表型是一種反常現象，表明質粒的存在與菌株的衰老呈正相關，質粒的轉移也引起衰老表型在菌株間的轉移，最終在寄主死亡之前或死亡之時，幾乎所有衰老菌株的mtDNA分子都是整合型，但游離的質粒也存在于培養物中。DNA的致死作用還不清楚,但有證據表明，質粒的過度復制使線粒體蛋白的合成受到抑制，則引起宿主菌的衰老。質粒Mauriceville和Kalilo插入方式與以前在真核或原核生物中觀察到的插入方式完全不同。其機理還有待深入研究。第56頁/共69頁五、質粒的復制

1.環狀質粒的復制脈孢菌環狀質粒的復制一直是較有興趣的研究課題。最新研究表明，Mauriceville編碼的反轉錄酶，與質粒的復制有關。2.線狀質粒的復制許多絲狀真菌中的線型質粒，都具有末端重復序列TIR和共價結合蛋白TP(表)。

第57頁/共69頁

表絲狀真菌中具有TIR和TP的線型質粒

質粒來源大小TIRTP

pA12Ascobolusimmerses5.6kb≈700bp有

pMC32Morchellacortica6kb≈750bp不詳

pCF637Ceratocystisfimbriata8.2kb不詳有

pFQ501Ceratocystisfimbriata6kb750bp不詳

pRS64立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)2.6kb不詳不詳

pEMAgaricusbitorquis7.3≈1kb不詳

pMPJAgaricusbitorquis3.6不詳不詳

kalDNA中脈孢菌(Neurosporaintermedia)

9kb1361bp有

第58頁/共69頁pFOXC1尖胞鐮刀菌(Fusariumoxysporum)pFOXC2尖胞鐮刀菌(Fusariumoxysporum)1.9kb50bp