第四講蛋白質的化學修飾第一頁，共九十六頁，2022年，8月28日一、概述指在溫和條件下，蛋白質側鏈基團與化學試劑形成專一性共價鍵的反應。涉及蛋白質側鏈及修飾劑的反應性兩個方面化學修飾的意義改造蛋白質，改善其功能性質，使適用于更廣泛領域；科學研究，例如酶的活性中心，致病性，藥物生物大分子相互作用、藥物設計等。第二頁，共九十六頁，2022年，8月28日⒈蛋白質功能基的反應性通過X射線分析蛋白質所得的數據顯示，多數非極性側鏈位于蛋白質分子的內部，而大部分極性側鏈則位于其表面。蛋白質分子表面不規則，極性也不相同。蛋白質功能基所處的微環境強烈影響它的物理和化學性質，同時也影響參與修飾的化學試劑接近，從而顯著影響對該功能基的化學修飾。第三頁，共九十六頁，2022年，8月28日就目前的研究成果來看，蛋白質的修飾反應都是親核反應。即與參與修飾的化學試劑是富電子的，進攻蛋白質側鏈基團的缺電子部分，反之亦然。第四頁，共九十六頁，2022年，8月28日特別注意：被修飾蛋白質側鏈基團的親核性與其pK值相關。

影響蛋白質側鏈基團pK值的因素有：

⑴微區極性決定基團解離狀態的關鍵因素之一。例如，溶菌酶中第Glu35的γ-羧基在水溶液中的pKa=5.9；當其與抑制劑三-N-乙酰氨基葡萄糖結合后，此時Glu35的γ-羧基pKa=6.4，上升了0.5。可能是由于抑制劑的加入，改變了該酶的構象，使該殘基微區極性降低之故。第五頁，共九十六頁，2022年，8月28日第六頁，共九十六頁，2022年，8月28日第七頁，共九十六頁，2022年，8月28日蛋白質構象改變會導致微區極性的局部改變，這種改變對Trp，Met和Cys的反應性影響最小;對氨基和咪唑基的反應性影響較大;而對Tyr，Hcys和COOH的反應性影響最大。此外，極性的變化也影響到反應類型。第八頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑵氫鍵效應氫鍵對維持天然蛋白質及其離子穩定性有重要影響，氫鍵的變化也可能導致pK發生改變。例如2-氯酚pK比2-溴酚pK值高0.7pH單位，這是由于氯與酚基形成氫鍵的能力比溴強。水楊酸的羧基可與其酚基形成氫鍵，結果使其羧基的pK值比正常值小1個pH單位，同時使酚基的正常pK10改變到pK13，因此，在蛋白質的酚基-羧基相互作用中，羧基的pK值應比正常值低，而酚基的pK值高于正常值。第九頁，共九十六頁，2022年，8月28日第十頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑶靜電效應蛋白質中組氨酸殘基的pK值是不同的。例如，碳酸酐酶和葡萄球菌核酸酶各有4個組氨酸殘基，pK值分別是：碳酸酐酶：5.916.047.007.23葡萄球菌核酸酶：5.375.715.746.50組氨酸在這兩個蛋白質中的pK值范圍是5.37～7.23，幾乎相差2個pH單位，可能是鄰近帶電基團相互影響所致。第十一頁，共九十六頁，2022年，8月28日總之影響蛋白質可解離氨基酸側鏈pKa值、可影響這些側鏈基團的反應性。蛋白質功能基的微區狀態不同，反應性不同。功能基反應性差異可通過競爭標記法來測定。第十二頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑷位阻效應蛋白質表面的側鏈基團旁有烷基等較大基團時，有基團空間位阻，影響與修飾劑接近及反應。例如，枯草桿菌蛋白酶的所有10個Tyr殘基均在分子表面，而且其酚羥基幾乎都不形成氫鍵。對它進行徹底硝化和碘化，10個Tyr中也只有8個被修飾，這很可能是空間障礙所引起的。此外，電荷轉移，共價鍵形成，金屬鰲合等都會改變蛋白質功能基的反應性。第十三頁，共九十六頁，2022年，8月28日⒉蛋白質功能基的超反應性超反應性是指蛋白質中的某側鏈基團與某試劑發生反應的能力。超反應性基團一般與蛋白質的某種功能性有關。超反應基團并不一定在酶的活性中心。例如，木瓜蛋白酶中的19個Tyr殘基中只有一個能與二異丙基氟磷酸反應，該殘基被修飾后并不一定使酶活性發生改變。第十四頁，共九十六頁，2022年，8月28日影響超反應性的因素很復雜包括；⑴功能基的pKa；⑵功能基的親核性；⑶吸引試劑并使其適當取向的能力；⑷功能基所在區域與修飾劑的立體化學適應性。⒊修飾劑的反應性蛋白質的構象和表面特性既影響氨基酸側鏈的反應性，也可能對接近功能基的修飾劑產生影響。第十五頁，共九十六頁，2022年，8月28日修飾劑修飾蛋白質反應的活性由以下因素所決定：⑴選擇吸附修飾劑與蛋白質功能基之間的選擇性吸附越強，反應性越大。⑵靜電相互作用帶電荷的修飾劑能被選擇性地吸引到蛋白質表面帶相反電荷的某一殘基定位。第十六頁，共九十六頁，2022年，8月28日例如，用碘乙酸和碘乙酰胺對His咪唑基烷基化的速度和烷基化部位的差異就是由于靜電作用造成的。（His的N-1或N-3的烷基化）第十七頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑶位阻因素蛋白質表面的位阻，或底物、輔助因子、抑制劑產生的位阻都可能阻止修飾劑與功能基的正常反應。例如，α-溴代丁酸可烷化核糖核酸酶His12，而且反應很快；若用α-溴代戊酸修飾，則很難進行反應；α-溴代己酸則不能發生反應，這顯然與位阻有關。第十八頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑷催化因素修飾部位附近的其它功能基，若有酸堿催化作用，也能影響修飾反應。例如，對硝基苯乙酸鹽和苯乙酸鹽以同一機理對胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸進行乙酰化，但苯乙酸鹽反應性差，這與酶的酸堿催化有關。硝基苯乙酸鹽對絲氨酸酶的反應性較高，這與Ser附近的路易斯堿與羧酸羥基氫作用，削弱該氧原子對羧基碳的吸電子相互作用有關。第十九頁，共九十六頁，2022年，8月28日第二十頁，共九十六頁，2022年，8月28日第二十一頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑸局部環境的極性溶劑極性可能與反應速度有關，如下表：反應類型降低極性對速度的影響⒈RSR+ICH2CONH2[R2S+CH2CONH2]I-適當或大大降低⒉RSR+H2O2R2SO+H2O沒有影響⒊RS-+ICH2CONH2R2SCH2CONH2+I-沒有影響⒋RN+H3+OCN-RNHCONH2適當或大大增加第二十二頁，共九十六頁，2022年，8月28日疏水環境能阻止產物電荷分離的反應（反應1），并能加速電荷中和的反應（反應4）；對于反應2（沒有電荷分離）和反應3，電荷只是從一個離子轉移到另一個離子，則介質是的極性是不重要的。第二十三頁，共九十六頁，2022年，8月28日二、化學修飾的方法學進行蛋白質修飾時，首先是選擇修飾劑和修飾條件，以期提高修飾反應的專一性，獲得滿意的修飾結果。其次，在修飾反應過程中，要建立適當的方法追蹤反應進程，以獲得與修飾有關的數據。然后分析獲得的數據，確定修飾部位和修飾程度，提出對修飾結果的合理解釋。第二十四頁，共九十六頁，2022年，8月28日一、控制修飾反應的專一性探索性研究時，對修飾對象的了解不多，所以選擇修飾劑和修飾條件至關重要，選擇的正確性直接影響到修飾反應的專一性和有效性。⒈試劑選擇不同實驗，對修飾的專一性要求也不同，因此選擇試劑在很大程度上要依賴修飾目的。例如，對氨基的修飾，僅修飾氨基；僅修飾α-氨基；修飾暴露的或反應性高的氨基。一般通過選擇試劑和反應條件來控制修飾的部位和程度第二十五頁，共九十六頁，2022年，8月28日如果希望改變蛋白質的帶電狀態或溶解性，應該選擇能引入最大電荷量的試劑。例如用順丁烯二酸酐可將中性的巰基和酸性條件下帶正電荷的氨基轉變成在中性pH下帶負電荷的衍生物。第二十六頁，共九十六頁，2022年，8月28日修飾對有機溶劑不穩定的蛋白質，必須在水介質中進行，應選擇在水中有一定溶解度的試劑。在選擇試劑時，應考慮反應生成物容易進行定量測定，即有特殊的光吸收或同位素標記等。選擇試劑時，應注意其體積，體積過大，引起的空間障礙大,而不能或不易與作用的基團接近。一般而言，試劑體積較小為宜。選擇試劑時，應該考慮修飾反應要達到的程度；修飾后蛋白質構象是否基本保持不變；是否需要分離修飾后的衍生物，反應是否需要可逆等因素。第二十七頁，共九十六頁，2022年，8月28日總之理想的修飾酶活性部位氨基酸殘基的試劑應該具備以下特征:即選擇性地與一個氨基酸殘基反應；反應須在酶蛋白不變性的條件下進行；標記的殘基在肽中穩定，易通過降解分離并進行鑒定；反應程度可用簡單的技術測定。但是，一種試劑往往不能同時滿足上述所有條件，所以必須根據具體實驗要求進行取舍。第二十八頁，共九十六頁，2022年，8月28日⒉選擇反應條件修飾蛋白質的反應條件，除允許修飾反應能順利進行外，還必須滿足：不造成蛋白質的不可逆變性;有利于專一性修飾蛋白質。為此，應盡量控制反應的溫度、pH值、反應介質和緩沖液等，以保證蛋白質特定空間構象盡量不變。第二十九頁，共九十六頁，2022年，8月28日⒊反應的專一性專一性對蛋白質的化學修飾至關重要，用以下途徑可以保證修飾的專一性：⑴選擇專一性試劑蛋白質分子的特殊空間結構能影響其某些基團的活性。例如DFP能與胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸作用，導致酶迅速失活。第三十頁，共九十六頁，2022年，8月28日第三十一頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑵選擇不同的反應pH均受pH的影響，控制反應pH值，可調控蛋白質分子各功能基的解離程度，從而控制修飾反應的專一性。例如，用碘乙酸或其酰胺可與半胱氨酸、甲硫氨酸、組氨酸的側鏈及α-氨基、ε-氨基發生作用；pH6時，它只專一的與組氨酸的咪唑基作用；pH值為3時，專一與Met作用（在酸性下，巰基和氨基都呈正離子，不活潑）。第三十二頁，共九十六頁，2022年，8月28日ICH2COOH+蛋白質-SH蛋白質-S-CH2COO-+H++I-(pH＞7)ICH2COOH+蛋白質-S-CH3

蛋白質-S（-CH3）-CH2COO-+I-(pH3)ICH2COOH+蛋白質-NH2

蛋白質-NH-CH2COO-+H++I-(pH＞8)ICH2COOH+蛋白質-His蛋白質-His（N-CH2COO-）+H++I-(pH6)第三十三頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑶利用某些產物的不穩定性高pH下，用氰酸、二硫化碳、O-甲基異脲和亞氨基酸等可轉變氨基成脲和胍的衍生物。雖然巰基也能與上述試劑作用，但因pH高，形成的產物迅速被分解。⑷親和標記親和試劑先以非共價鍵結合到蛋白質的活性部位，再發生化學作用。因此親和標記試劑必須與蛋白質作用的底物或抑制劑相似，可順利到達修飾位點，而且還能與特定活性基團反應。例如，利用對甲基苯磺酸氯（CH3-C6H4-SO2Cl），就能作用于胰凝乳蛋白酶的活性絲氨酸上。第三十四頁，共九十六頁，2022年，8月28日第三十五頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑸差別標記以底物或抑制劑保護蛋白質的活性部位基團，使其不能與修飾試劑作用，可修飾非必需基團。然后將過量的底物或抑制劑除去，獲得部分修飾的蛋白質。將其與同位素標記的同樣試劑作用，則獲得帶有放射性同位素標記的蛋白質活性中心基團。第三十六頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑹利用蛋白質狀態的差異在不同狀態下，蛋白質的構象有差異，暴露的基團也不同，因此在不同狀態下修飾，可獲得相關信息。例如，在結晶狀態下修飾，可提高修飾的專一性。核糖核酸酶在晶體狀態下進行羧甲基化時，反應主要集中在His119，而對His12的修飾則很少，兩者之比為60∶1；在溶液中該反應的比例為15∶1。第三十七頁，共九十六頁，2022年，8月28日二、確定修飾程度和修飾部位通過對被修飾蛋白質的降解和氨基酸分析后鑒定修飾部位。通過純化被修飾蛋白質的氨基酸及其衍生物，測定其同位素標記量或光譜強度或順磁共振譜或熒光標記量等來確定反應程度。一般認為：測定被修飾的氨基酸，要比測定氨基酸的減少量更準確。第三十八頁，共九十六頁，2022年，8月28日三、化學修飾數據的分析⒈化學修飾的時間進程曲線以修飾時間對蛋白質活性作圖可以了解修飾殘基的性質和數目，修飾殘基與蛋白質活性的關系，實際上是蛋白質失活速度常數的測定若蛋白質活性僅與某個殘基有關，則可用公式（后面）表示LogE1/E0=-K失活·tE1為時間t時的活力，E0為初始活力，E1/E0為時間t時的殘余活力第三十九頁，共九十六頁，2022年，8月28日用殘余活力的對數對時間作圖，即可求出失活的速度常數第四十頁，共九十六頁，2022年，8月28日若蛋白質活力與兩個以上的殘基有關，而且與修飾劑反應速度不相同，可獲得多相修飾半對數圖第四十一頁，共九十六頁，2022年，8月28日⒉確定必需基團的性質和數目蛋白質分子中某些側鏈基團在功能上雖有必需和非必需之分，但它們往往都能與某一試劑起反應。1961年Ray等提出用比較一級反應動力學常數來確定必需基團的性質和數目的方法，但是該法的局限性大，現基本被放棄。第四十二頁，共九十六頁，2022年，8月28日1962年，鄒承魯提出更具普遍應用意義的統計學方法，即鄒氏作圖法該法認為：當試劑僅作用于蛋白質分子中一種基團，而且必需基團和非必需基團與試劑作用的速度相同時，活力變化與修飾殘基之間有如下關系：α1/i=X；[x=（n-m）/n]α為實驗測得的平均活力剩余分數，x是基團的保留分數，n為蛋白質分子中可被修飾的基團總數，m為已被修飾的基團數。第四十三頁，共九十六頁，2022年，8月28日當n為已知時，x可由實驗測得的m值計算而得。由上式兩邊取對數，以logα對logx作圖得直線，其斜率即為必需基團數i。當n為未知時，x無法求得，但可根據上式給定一系列的i值（1，2，3……）。使得α1/i對m作圖為一直線的那個i值。第四十四頁，共九十六頁，2022年，8月28日蛋白質分子中的必需基團和非必需基團與修飾劑的作用速度明顯不同，假定該基團總數為n，并將其分為三類；一類是反應速度最快的必需基團，總數為s，二是p個反應速度較慢的基團，其中i個必需基團；三是反應最慢的基團，其數目為（n-p-s）。這時，活力的變化與修飾程度間的關系是：α1/i=（p+s-m）/p或α1/i=（n/p）x-（n-p-s）/p，其中，m是被修飾的基團數，x=（n-m）/n為基團剩余分數。以α1/i對m或x作圖，可以確定必需基團數i，也可由斜率和截距求得p和s。第四十五頁，共九十六頁，2022年，8月28日鄒氏方法為蛋白質化學修飾研究由定性描述轉入定量提供了理論依據和計算方法，可用于蛋白質設計。第四十六頁，共九十六頁，2022年，8月28日四、化學修飾結果的解釋⒈蛋白質功能改變⑴確認試劑已經作用于蛋白質；⑵確認修飾蛋白質的構象是否發生顯著變化；⑶確認修飾發生在何處，常用的方法有：①修飾發生在活性部位的必須基團，蛋白質活性的喪失與修飾程度存在一定的化學計量關系。②底物保護與修飾蛋白失活程度的關系分析。第四十七頁，共九十六頁，2022年，8月28日⒉注意分析修飾殘基的穩定性許多反應，如酰基轉移、巰基轉移、鹵素轉移及二硫鍵交換過程可能自發地或在純化、降解過程中發生。例如，蛋白質中的碘代酪氨酸除對光和氧敏感外，在層析或在弱酸性介質中，有碘離子存在時，能發生脫碘化作用。又如，光敏化的組氨酸經酸水解后，產生許多未知產物，但這些未知產物峰的位置與正常氨基酸的峰位重疊。應引起特別注意，以區分修飾的真偽。第四十八頁，共九十六頁，2022年，8月28日四、蛋白質側鏈的修飾蛋白質側鏈上的功能基主要有；氨基、羧基、巰基、吲哚基、胍基、甲酰基等，修飾上述每一種功能基都有好多種試劑可以利用，這里不再介紹。僅介紹那些應用廣泛，又能達到某種特殊目的的試劑，并且以專一性為主。第四十九頁，共九十六頁，2022年，8月28日⒈氨基的修飾氨基的修飾可分為三類：引入正電荷的修飾；電荷消失的修飾；引入負電荷的修飾。賴氨酸的ε-NH2以非質子化形式存在時很活潑，可被選擇性修飾第五十頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑴引入正電荷的修飾下列試劑修飾氨基后，在賴氨酸側鏈上留下可電離的帶正電基團①還原烷基化醛與賴氨酸側鏈反應形成席夫堿，再用硼氫化鈉還原席夫堿，獲得穩定衍生物E-NH2+RCHOE-NH-CHRE-NH-CH2R所用的醛可有不同的R基團，如甲醛、乙醛、丙醛等，用這些試劑修飾，可獲得側鏈微環境方面的信息第五十一頁，共九十六頁，2022年，8月28日②用烴基亞酰胺脒化（例如甲基乙亞酰胺）反應所產生的衍生物在酸、中性pH下穩定，在堿性pH下不穩定第五十二頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑵消除電荷的修飾這類試劑可抑制賴氨酸的ε-NH2的質子化，使形成的衍生物不帶電。①乙酰化在微堿性pH下，乙酸酐很容易與氨基作用，但是乙酸酐此時也能與巰基和咪唑基發生反應，應在較低溫度下進行。第五十三頁，共九十六頁，2022年，8月28日②甲氨酰化作用氰酸鹽與氨基反應形成非常穩定的衍生物，同時能與巰基、酚基、羧基、咪唑基發生反應，然而，除氨基衍生物外，其余反應產物在微堿性（pH～8）條件下不穩定，該反應應用廣泛，一個明顯的優點是氰酸鹽離子體積小。副反應如下第五十四頁，共九十六頁，2022年，8月28日第五十五頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑶引入負電荷的反應①磷酸吡哆醛修飾磷酸吡哆醛修飾專一修飾氨基，賴氨酸殘基在中性pH下與磷酸吡哆醛（PLP）反應，形成希夫堿，再用硼氫化鈉(NaBH4)還原，得賴氨酸的不可逆修飾物，此產物不僅帶負電，而且在325nm處有最大吸收，可用于定量測定。產物還有強烈熒光。第五十六頁，共九十六頁，2022年，8月28日第五十七頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑵酰化反應第五十八頁，共九十六頁，2022年，8月28日⒊精氨酸胍基的修飾具有鄰位羰基的化合物可與精氨酸的胍基形成穩定的雜環產物，常用的試劑有丁二酮，苯甲酰甲醛和乙二醛。雖然胺或巰基也能與試劑作用，但在中性pH下，其反應速度遠比胍基慢。在碳酸氫鹽緩沖液中，苯甲酰甲醛與精氨酸反應較快，而α-NH2在同樣條件下不反應。第五十九頁，共九十六頁，2022年，8月28日第六十頁，共九十六頁，2022年，8月28日第六十一頁，共九十六頁，2022年，8月28日⒋羧基的修飾用水溶性碳二亞胺專一修飾蛋白質中的羧基。在這個修飾中，碳二亞胺先活化羧基，活化的中間體通過ON酰基轉移而重排，或者與加入的親核物形成相應的酰胺，該法應用廣泛。絲氨酸、半胱氨酸和酪氨酸在一定條件下也能發生該反應第六十二頁，共九十六頁，2022年，8月28日第六十三頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑸巰基的修飾半胱氨酸是蛋白質中反應性最強的殘基，所以很多試劑可用來修飾巰基側鏈，常用的試劑有三類，即碘乙酸和碘乙酰胺或環乙烯亞胺；馬來酰亞胺或馬來酸酐；有機汞試劑如對氯汞苯甲酸，其反應分別如下第六十四頁，共九十六頁，2022年，8月28日副反應第六十五頁，共九十六頁，2022年，8月28日第六十六頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑹組氨酸咪唑基的修飾常用試劑是焦磷酸二乙酯和碘乙酸，用碘乙酸烷化組氨酸殘基可獲得單取代或雙取代的衍生物第六十七頁，共九十六頁，2022年，8月28日焦碳酸二乙酯修飾組氨酸特別有用，它在中性pH下有較好的專一性，能使咪唑環上的一個氮原子羧乙基化，產物在240nm處有最大吸收，可用來追蹤反應和定量測定。羥胺使上述反應可逆進行，從而回收組氨酸。焦碳酸二乙酯也能使酪氨酸、賴氨酸或半胱氨酸的側鏈發生相應的反應，但是在pH6時的反應速度慢，而且與賴氨酸或半胱氨酸的側鏈的反應無可逆性。第六十八頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑺色氨酸吲哚基的修飾N-溴代琥珀酸亞胺（NBS）常用來修飾色氨酸，它使吲哚基氧化成為羥基吲哚衍生物，導致吲哚基在280nm處的吸收值降低。該反應必須小心進行，若濃度過大，可使修飾的色氨酸殘基處的肽鍵斷裂。此外，酪氨酸也能與NBS作用并干擾吲哚基的測定。各種芐基鹵化物能使吲哚基環烷基化，最常用的是2-羥基-5-硝機基芐基溴及其類似物二甲基（2-羥基-5-硝基芐基）锍鹽。這些試劑在沒有半胱氨酸殘基時，對色氨酸是很專一的第六十九頁，共九十六頁，2022年，8月28日帶硝基取代基的硫基鹵化物的專一性與锍鹽類似，但是能產生單一產物，避免了锍鹽修飾產物的不均勻性，而且產物的光譜性質可用來定量測定色氨酸第七十頁，共九十六頁，2022年，8月28日五、化學交聯技術在蛋白質研究中的應用定義：用雙功能試劑或交聯劑將兩個分子結合起來的化學反應。在蛋白質中，其肽鏈末端基團及側鏈親核基團都是交聯的功能基，因此，交聯技術廣泛用于研究蛋白質的活性基團。目前，交聯仍是研究蛋白質活性基團等的最有效，最多樣化的技術之一。該技術可用于研究蛋白質的相互作用，不但可以確定蛋白質的相鄰亞基，還可以確定相互作用蛋白質間的最大間距等。第七十一頁，共九十六頁，2022年，8月28日在交聯時要使用交聯劑（包括使用酶）必須注意兩點：交聯是一個經驗過程，無法預測哪種蛋白質在何種條件下與何種交聯劑發生反應，需要對各種實驗條件及試劑進行篩選以獲得最佳交聯效果；其次，對未發生交聯的原因解釋要極其謹慎，即遵守“無證據并不證明不存在”的格言。對于兩個發生交聯的相互作用蛋白質，其功能基團如側鏈，需要正確定位且有足夠的活性，才會被適當的交聯劑所修飾。第七十二頁，共九十六頁，2022年，8月28日⒈體內與體外交聯反應的特點交聯法既可在體外、也可在體內進行。在體內，蛋白質組分的復雜性及集中度要遠遠大于體外環境，因此，應使用短交聯劑就可達到交聯鄰近的蛋白質的目的。⑴體內交聯的特點在體內，只有有相互作用關系的蛋白質之間才可能“臨近”，因此體內交聯更具有特異性。第七十三頁，共九十六頁，2022年，8月28日在體內交聯研究時，通常使用脂溶性疏水性交聯劑，例如甲醛，CS2，碳化二亞胺等，他們可以穿過細胞膜。但是，一定要注意到：要確定或控制細胞內交聯特異性最適合條件是極其困難的；此外，交聯劑可以與大量其它蛋白質相互作用，其中包括細胞表面蛋白，整合膜蛋白，胞漿內蛋白及核蛋白。而且代謝產物及非蛋白組分也是交聯劑的潛在競爭劑，特別是當它們具有與蛋白質側鏈同類的反應基團時，如胺類、羧化物或者硫醇。第七十四頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑵體外蛋白質交聯的特點在體外交聯更有可能同時控制交聯的特異性及條件。例如，水溶性及脂溶性的交聯劑可分別用于修飾相互作用的親水區及疏水區。pH、反應物濃度及反應溫度也易于控制。體外交聯還允許對蛋白質及其復合物的純度進行優化，以使蛋白質的交聯模式更易解釋。體外交聯的另一個優點是有大量的交聯劑可以選擇。第七十五頁，共九十六頁，2022年，8月28日⑶注意事項必須以交聯目的來選擇交聯方法。例如，想要說明整合膜蛋白質的相互作用最好選用體內交聯方法；研究細胞因子受體之間的相互作用是在激活配體的情況下將細胞表面受體交聯，可在體外進行；而包漿內蛋白質之間的相互作用則既可在體外、又可在體內進行。只要有可能應盡量選用體外法進行交聯。即使是在最適條件下進行交聯反應，反應體系中也至少會產生三種不同的共價修飾形式，分別為單取代蛋白、分子內交聯及分子間交聯。第七十六頁，共九十六頁，2022年，8月28日單取代蛋白是指蛋白質僅被交聯劑中的一個活性基團修飾時所形成的單取代連接分子內交聯是指蛋白質或交聯劑的濃度較低、或交聯劑的長度只能在同一蛋白質內，而不是鄰近空間相鄰側鏈形成交聯橋時，易形成單個多肽鏈的分子內交聯當交聯劑的幾何形狀、化學性質、柔韌性、跨度均適合于共價連接兩個分離蛋白的反應側鏈時，則形成分子間交聯第七十七頁，共九十六頁，2022年，8月28日蛋白質含有大量有活性的氨基酸側鏈基團，可以被不同類型的化學交聯劑選擇性識別。氨基酸分為疏水的脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和親水的極性氨基酸，除少數例外，均是第二類氨基酸中的親核側鏈參與交聯。第七十八頁，共九十六頁，2022年，8月28日⒉pH的影響大部分交聯反應都是親核取代反應，其中，對親核氨基酸側鏈的攻擊使一對電子轉移至交聯劑，造成交聯劑離去基團的直接取代并在交聯劑與蛋白質側鏈間形成了共價鍵。所有這種親核取代發生的反應速率依賴于交聯劑的離去基團是否易被置換以及攻擊側鏈的親核性。在蛋白質中發現的最有效的親核側鏈是R-S-，即陰離子的半胱氨酸去質子化硫酸鹽。質子化會減低該基團及其它可電離的反應側鏈作為電子對提供者的有效性，從而降低其親核性。因此，pH是影響交聯反應的最重要因素。例如pH從其pka上升兩個單位，則去質子化側鏈的百分比將從50%升至99%，反應活性也相應升高。第七十九頁，共九十六頁，2022年，8月28日⒊交聯劑的類型最普通的化學交聯劑是雙功能試劑，即具有兩種化學反應基團，可以與蛋白質靶的兩條側鏈發生反應，從而形成交聯復合體的化合物。交聯劑中將這兩個反應基團相連接的部分稱為間隔段或接合部。該間隔段除了確定著兩個反應基團的距離外，還提供了其它重要特征。例如，間隔段內含有二硫鍵，就會對于還原劑產生的化學裂變異常敏感，這種化合物稱為可裂變交聯劑。間隔段也為分析交聯劑的幾何學參數及溶解性提供線索。第八十頁，共九十六頁，2022年，8月28日同型雙功能或異型雙功能交聯劑具有相同或不同反應基團的雙功能交聯劑分別稱為同型雙功能或異型雙功能交聯劑，異型雙功能交聯劑的優勢在于可以用不同功能的基團選擇不同類型的親核側鏈，而且可以使兩步交聯反應在不同的條件下單獨進行。第八十一頁，共九十六頁，2022年，8月28日第八十二頁，共九十六頁，2022年，8月28日光活化交聯劑光活化交聯劑是一種經常使用的異型雙功能交聯劑，它同時具有化學反應基團及光反應基團，后者暴露與適當波長的光下即可激活。三功能交聯劑是最新研制的一種試劑，含有呈三角形分布的三個反應基團，三羥甲基磷化氫是其中的一種，其三個化學反應臂能與三個靶蛋白形成交聯。第八十三頁，共九十六頁，2022年，8月28日第八十四頁，共九十六頁，2022年，8月28日第八十五頁，共九十六頁，2022年，8月28日第八十六頁，共九十六頁，2022年，8月28日第八十七頁，共九十六頁，2022年，8月28日零距離交聯劑這種交聯劑可以激活靶蛋白側鏈的功能性基團，無須插入任何外源間隔段即可在側鏈間形成共價鍵。應用最多的零距離交聯劑是碳二亞胺，它激活羧基形成活化的酰化異脲中間體，繼而被胺類修飾，與氨基與羧基間形成酰胺鍵。氰也能將相互作用蛋白質之間的鹽橋賴氨酸酰基與酸性氨基酸共價連接。由于氰是一種氣體試劑，可以輕易穿過細胞膜，因此可以用于體內交聯，轉谷氨酰胺酶是另一種，催化相互作用蛋白質的谷氨酰基與賴氨酰基間形成異肽鍵.第八十八頁，共九十六頁，2022年，8月28日交聯的特異性及選擇性交聯的特異性是指通過交聯檢測到的蛋白質間可能發生的相互作用選擇性是指交聯劑對某種特定的氨基酸側鏈的專一程度。特異性與選擇性密切相關，選擇性低的交聯劑會造成大范圍的修飾，因此其特異性低。第八十九頁，共九十六頁，2022年，8月28日用交聯劑