基因工程

第四講：將DNA引入活細胞IntroductionofDNAintoLivingCells講課提綱

概述4.1轉化-使細菌細胞獲取DNA4.2重組體的鑒定4.3將噬菌體DNA引入細菌細胞4.4重組噬菌體的鑒別4.5非細菌細胞的轉化在創造出新的重組DNA分子后，接下來的步驟是將這些分子引入到活細胞中，通常情況下是細菌，并隨著活細胞的生長和分裂產生出克隆。嚴格地講，“克隆”這個詞僅指后面過程，并不包括重組DNA分子構建本身。基因克隆的目的(1)目的(1)：

從有限數量的起始材料中產生出大量的重組DNA分子。用細菌中的質粒進行擴增，可以得到開始階段的上千倍重組DNA分子。基因克隆的目的(2)純化是克隆的第二個重要功能。重組DNA分子過程中，連接反應的混合物中可有其他的DNA分子：(1)未連接上的載體分子；(2)未連接上的DNA片段；(3)沒有插入新DNA而重新閉合的載體分子(“自連接”載體)；(4)攜帶插入錯誤DNA片段的重組DNA分子。未連接的分子很少造成污染：

因為即便它們會被加入到細菌細胞中，也只有在非常例外的情況下才能發生復制。更多的情況下，宿主細胞中的酶會降解這些DNA碎片。自連接的載體分子和錯誤重組的質粒與目的分子以相同的效率被復制。通過克隆可以實現目的分子的純化：對于任何一個細胞來說，攜帶超過一個DNA分子是非常罕見的。每個細胞都產生單一的克隆。不同的克隆包含有不同的分子：一些包含了目的重組DNA分子，一些包含自連接的載體分子。因此問題就轉變成，如何鑒別出包含有正確重組質粒的克隆。4.1轉化-使細菌細胞獲取DNA絕大多數種類的細菌能夠從它們生長的培養基中獲取DNA分子。通常這種DNA分子都會被降解掉；偶爾DNA分子存活下來并復制；特別是帶有復制起始點的質粒時，這種現象更有可能發生。判斷質粒是否被獲取和穩定地保持，通常是通過質粒所攜帶基因的表達情況來進行檢測。例如，大腸桿菌細胞正常情況下對氨芐青霉素和四環素的生長抑制效應敏感，但是，包含有質粒pBR322的細胞，對這些抗生素有抵抗力。因為pBR322質粒含有兩組基因：一個基因編碼能夠將氨芐青霉素修飾成對細菌無毒害作用的β-內酰胺酶；另一組編碼使四環素無毒化的酶。4.1.1不同細菌獲取DNA效率不同在自然條件下，轉化很可能不是一個細胞獲取遺傳信息的主要方式。在實驗室中只有很少種類能夠很容易地被轉化，它們都具有復雜的結合和獲取DNA的機制。絕大多數細菌，僅能在正常條件下獲取有限數量的DNA。為了高效地轉化這些細菌，不得不讓細菌經歷一些物理和／或化學處理以增強它們獲取DNA的能力。經歷了這種處理的細菌細胞被稱作感受態細胞。4.1.2大腸桿菌感受態細胞的制備人們發現，經過冷的鹽溶液浸泡的大腸桿菌細胞，相比未經浸泡的細胞獲取外源DNA要高效得多。習慣上使用50mM氯化鈣溶液。

尚不非常清楚這一處理如何發揮作用的。可能原因：CaCl2使DNA在細胞外側沉淀；鹽溶液造成細胞壁的某種改變增強了對DNA的結合。當DNA加入到經過處理的細胞時，會吸附在細胞外表面并保持這一狀態，這一步驟并不會發生DNA轉化入細胞的反應(圖5-3)。DNA真正進入感受態細胞，需要經過一次短暫的升高溫度到42℃的刺激反應，但為什么這種熱休克法能夠有效促進細胞轉化還不為人們所知。4.1.3對轉化細胞的選擇盡管進行了前述處理，轉化效率仍然很低。必須找到一些方法，能夠辨別出轉化細胞。辦法：使用攜帶有選擇性標記的質粒。選擇性標記：給轉化細胞帶來新的性質的基因，而這樣的性質是未轉化細胞所不具備的。例子：pBR322的氨芐青霉素抗性基因。轉化實驗后：只有吸收了質粒的大腸桿菌細胞才表現出ampRterR的性質，并在含有氨芐青霉素或四環素的瓊脂培養基上形成菌落；未發生轉化的細胞仍然是ampSterS，不能夠在選擇性培養基上生成菌落。因此，轉化細胞和未轉化細胞得到了區分。絕大多數質粒克隆載體，都至少攜帶一種賦予宿主細胞耐抗生素的基因，通過將這些宿主細胞鋪到含有相關抗生素的瓊脂培養基上來達到對轉化細胞的篩選。需要記住的是，對抗生素的耐藥性不能僅僅歸因于轉化細胞中質粒的存在。質粒中的抗藥基因必須能夠被表達，從而合成出把抗生素脫氧化的酶。抗藥性基因的表達在轉化后立刻開始進行，但是在細胞能夠包含足夠的消除抗生素毒性作用的酶之前，還需要幾分鐘的時間。所以，轉化后的細菌不能在熱休克處理后立刻鋪到選擇性培養基上，而是要首先加入一個小體積的不含抗生素的液體培養基中，并培育一段較短的時間，質粒復制和表達就能夠開始進行。這樣在細胞被鋪到選擇性培養基上，并遭遇到抗生素時，它們已經合成出了足夠的耐藥性酶，來保證自己能夠存活于選擇性培養基中。4.2重組體的鑒定如何區分攜帶重組DNA分子的菌落和含有自連接載體分子的菌落？因為絕大多數插入DNA片段的過程都不可避免地會破壞質粒分子中原本存在的某個基因的完整性（插入失活）。所以只要鑒別出該基因在轉化細胞中已經失去活性，即不再表現出該基因的性質，就可以確定重組體的存在。4.2.1pBR322重組體的篩選-

抗生素抗性基因的插入失活在插入新的DNA片段前，pBR322有一些獨一無二的限制性位點，可以打開載體分子，供DNA片段插入。如：僅有一個BamHI位點，位于編碼耐四環素藥性的基因內部。在BamHI位點插入DNA片段的重組pBR322分子，就不再能賦予其宿主細胞耐四環素的性質，這樣該基因就被插入的外源基因破壞。含有重組pBR322分子的細胞依然能夠對氨芐青霉素保持耐藥性，但對四環素變得敏感(ampRterS)。方法：1.轉化后細胞鋪到含氨芐青霉素的培養基上培養到出現菌落。所有這些菌落都是轉化細胞(未轉化細胞是ampS，不能夠在選擇培養基上產生菌落)，但只有一小部分包含重組pBB322分子；絕大多數是正常的自連接質粒。2.為了鑒別出這些重組體，菌落被復制培養(replicaplated)到含有四環素瓊脂培養基上。生長出來的菌落：攜帶有正常的pBR322質粒而沒有插入DNA；沒有生長的菌落含有重組體：ampRterS一旦知道了重組體的位置，可以從最初的氨芐青霉素瓊脂平板上分離樣品。4.2.2插入失活不僅僅針對抗生素抗性一些重要質粒載體使用的是不同的篩選系統。pUC8：攜帶有耐氨芐青霉素基因和lacZ'基因。

lacZ'基因編碼β-半乳糖苷酶的一部分。利用pUC8作載體，利用的是lacZ'基因的插入失活，重組體不能合成β-半乳糖苷酶而被鑒別出來。β-半乳糖苷酶：是一系列將乳糖降解成為葡萄糖和半乳糖的酶中的一種。通常由lacZ'基因編碼，該基因位于大腸桿菌染色體上。一些大腸桿菌菌株攜帶有經過修飾的lacZ'基因，該基因編碼的蛋白相對于正常的lacZ'基因編碼的β-半乳糖苷酶缺失了α-肽段的一部分。這些突變體只能夠在其俘獲一個攜帶有細菌基因組缺失的lacZ'基因的質粒時，比如說pUC8，才能夠合成β-半乳糖苷酶。判斷β-半乳糖苷酶是否存在：化學方法：乳糖被分解成葡萄糖和半乳糖；檢測酶所催化的一個反應。X-gal是乳糖相似物，該物質能夠被β-半乳糖苷酶降解并生成深藍色的產物。如果X-gal(以及β-半乳糖苷酶的誘導物IPTG)和氨芐青霉素一起被加入到瓊脂平板中：不含重組體的菌落，即能夠產生β-半乳糖苷酶的細胞就將被標記成藍色；含有重組體的菌落因為lacZ‘基因被破壞而無法合成β-半乳糖苷酶，將保持白色菌斑。這一系統被稱作乳糖篩選(Lacselection)。4.3將噬菌體DNA引入細菌細胞將一個用噬菌體載體構建的重組DNA分子引入細菌細胞，有兩種不同的方法：

轉染；體外包裝。4.3.1轉染這一過程與轉化是相同的，區別：使用的質粒載體換成了噬菌體。像質粒那樣，將純化的噬菌體DNA或重組噬菌體分子與感受態大腸桿菌細胞混合，并通過熱休克將DNA引入到大腸桿菌細胞中。4.3.2體外包裝λDNA分子與成熟的λ噬菌體顆粒相比，對培養中的細菌細胞的侵染，沒有那么高效。因此，如果λ分子能夠在試管中被包裝到λ噬菌體的頭尾結構中，將變得非常有用。包裝需要一定數量的由λ基因組編碼的蛋白質，這些蛋白可以從缺陷性λ噬菌體侵染的菌株中高濃度制得。所以，需要用到兩個不同的體系。1.在單菌株體系中，缺陷性λ噬菌體在C0S位點有一個突變，因此內切酶不能識別C0S位點，不能切割λ連環體，造成缺陷性噬菌體無法完成復制。但它能夠直接合成包裝所需的全部蛋白。從細菌中收集蛋白并純化，隨后用于重組λDNA分子的體外包裝。2.第二個體系中需要用到兩個缺陷性λ噬菌體株。兩個噬菌體株都在編碼噬菌體蛋白外殼的某一組分基因帶有一個突變位點：一個突變發生在D基因上；另一個突變發生在E基因上。由于突變基因造成的產物缺乏，導致完整的噬菌體衣殼結構無法形成，同時其他的噬菌體衣殼蛋白不斷積累。所以，任何一個噬菌體株都無法完成在大腸桿菌中的侵染循環。如果使用兩種細胞，一種被缺乏D基因的噬菌體侵染，另一種被缺乏E基因的噬菌體侵染，通過將兩種細胞的裂解物混合在一起，就制得了體外包裝的混合物。現在的混合物包含了所有必需的成分，能夠將重組λ分子包裝到成熟的噬菌體顆粒中。通過這兩個體系，只需要把包裝后的分子加入到細菌培養物中，就使得正常的λ侵染過程得以發生，進而可以把重組DNA分子引入到大腸桿菌細胞中。4.3.3噬菌體侵染的可視化形式噬菌體侵染循環的最后一個階段是細胞溶解。如果加入噬菌體后，或在噬菌體DNA侵染發生后，被侵染細胞被立刻引入固體瓊脂培養基，細胞溶解就能夠以噬菌斑(plaque)的形象在菌苔上被觀察到。每個噬菌斑都是一個噬菌體溶解細胞后留下的空白區域，能夠發生轉移并最終消化鄰近的細胞。λ噬菌體和M13噬菌體都能夠形成噬菌斑。λ噬菌體：真正的噬菌斑，因為細胞溶解；M13：噬菌斑稍有不同，因為M13無法溶解宿主細胞，導致被侵染細胞生長速度下降。這種下降足以在菌苔上產生一個相對空白的區域，和正常噬菌斑一樣清晰可見。λ和M13載體的最終結果是得到一塊存在著噬菌斑的瓊脂平板。每個噬菌斑都是由單一的被轉染或被侵染細胞形成，含有相同的噬菌體顆粒。這些噬菌體顆粒可能由自連接的載體分子或重組分子所組成。4.4重組噬菌體的鑒別4.4.1噬菌體載體的lacZ'基因插入失活所有M13克隆載體，以及部分λ克隆載體，攜帶有lacZ'基因的拷貝。正如質粒載體pUC8那樣，在lacZ'基因內插入新的DNA會導致β-半乳糖苷酶合成失效。重組體能夠通過將細菌細胞鋪在X-gal瓊脂培養基上鑒別出來：包含正常噬菌體的噬菌斑是藍色；重組體噬菌斑是無色透明。4.4.2λcI基因的插入失活一些類型的λ克隆載體在cI基因上有獨一無二的限制性位點(圖2-9上圖譜位置38)。cI基因的插入失活導致噬菌斑形態上的改變:正常的噬菌斑顯得“混濁”；

cI基因被破壞的重組體形成的噬菌斑“清澈”。對于有經驗的觀察者來說，這種不同是相當明顯的。4.4.3使用Spi表型的篩選在正常情況下，λ噬菌體不能夠侵染那些已經整合了噬菌體P2的大腸桿菌細胞。因此λ被稱作Spi(P2prophageinhibition)。一些λ克隆載體被設計成，外源DNA的插入會把載體從Spi+轉變成Spi-，使得重組體能夠侵染攜帶P2前噬菌體的細胞。在克隆實驗中，攜帶P2前噬菌體的細胞作為這些載體的宿主；只有重組體是Spi-，因此也只有重組體才能夠產生噬菌斑。4.4.4基于入基因組大小的篩選組裝成熟噬菌體顆粒的包裝體系，只能夠將大小37到52kb的DNA分子插入到噬菌體頭部結構中。任何小于37kb的DNA分子都不被包裝。許多λ載體通過刪除λ噬菌體DNA分子上大的部分而構建出來，因此長度小于37kb。這些載體只有在額外DNA插入，使整個基因組長度達到或超過37kb后，才能夠被包裝到成熟噬菌體顆粒中。因此，只有重組的噬菌體才能夠進行復制。4.5非細菌細胞的轉化如果酵母、真菌、動物和植物細胞被用作基因克隆的宿主，那么有必要開發出將DNA引入這些細胞的方法。盡管用氯化鋰或醋酸鋰處理會增強酵母細胞對DNA的吸收，并被頻繁地使用在釀酒酵母的轉化中，但通常來說，浸入鹽水促進轉化只對少數細菌有效。因而，對絕大多數更高等的生物來說，需要使用更加復雜的方法。4.5.1單個細胞的轉化培養后的動物細胞，可以很容易的被轉化，尤其當DNA在磷酸鈣作用下在細胞表面沉淀時更是如此。對于其他類型的細胞，解