第二章第十三節基因工程藥物的制造實例一、干擾素干擾素（interferon，IFN）是人體細胞分泌的一種活性蛋白質，具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調節活性，是人體防御系統的重要組成部分。根據分子結構和抗原性的差異分為α、β、γ、ω等4個類型。α型干擾素再分為α1b、α2a、α2b等亞型，其區別表現為個別氨基酸的差異。早期干擾素是用病毒誘導人白血球產生的，產量低、價格昂貴，不能滿足需要。現在可以利用基因工程技術在大腸桿菌中表達、發酵來生產干擾素。1.基因工程菌的組建組建過程：分離干擾素mRNA，以mRNA為模板反轉錄合成cDNA，將cDNA克隆到載體中并轉化大腸桿菌K12，獲得干擾素基因工程菌。所克隆的干擾素cDNA是從抗病毒活性最高的12SmRNA區域合成的。克隆載體pBR322質粒，含有四環素和氨芐青霉素抗性基因。pBR322質粒結構圖重組人干擾素產品組建干擾素工程菌的流程誘生的白細胞提取全RNA

通過寡dT-纖維素柱獲得mRNA5%～23%蔗糖密度梯度離心提取12S的mRNA

自mRNA反轉錄成cDNA雙鏈cDNA用末端DNA轉移酶接上dT或dG尾pBR322質粒pBR322質粒DNA的PstⅠ酶切割加上dA或dC

退火獲得雜交質粒轉化大腸桿菌K12擴增雜交質粒篩選抗四環素但對氨芐青霉素敏感的細菌克隆

用已知干擾素的DNA片段作為探針挑選富有干擾素cDNA的克隆

將干擾素cDNA克隆入表達載體在大腸桿菌中進行高效表達

2.基因工程干擾素的制備制備基因工程α-干擾素工藝流程如下：啟開種子制備種子液發酵培養粗提半成品檢定半成品制備精提

分裝凍干成品檢定成品包裝α2b干擾素生產過程1.發酵工程菌：SW-IFNα-2b/E.coliDH5α，質粒用PL啟動子，含氨芐青霉素抗性基因。培養基含1%蛋白凍、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl。接種后搖床培養30℃，10h，發酵種子。15L發酵罐培養，30℃，轉速500r/min，8h。然后42℃下誘導，2～3h。離心去上清。2.產品的提取與純化

4000r/min離心30min，去上清后，濕菌超聲破碎，離心，取沉淀部分用溶解緩沖液進行處理，上清超濾濃縮，SephadexG-50分離。經SDS檢查。再經DE-52柱純化。3.質量控制標準和要求3.1半成品檢定⑴干擾素效價測定⑵蛋白質含量測定⑶比活性⑷純度測定⑸相對分子量測定⑹殘余外源性DNA含量測定⑺殘余血清igG含量測定⑻殘余抗生素活性測定⑼紫外光譜掃描⑽肽圖測定⑾等電點測定⑿除菌半成品干擾素效價測定、無菌試驗、熱原試驗。3.2成品檢定⑴物理性狀⑵鑒別試驗⑶水分測定⑷無菌試驗⑸熱原試驗⑹干擾素效價測定⑺安全試驗二、人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor，GMCSF）是一個具有多項潛能的造血生長因子，它不僅能夠促進造血前體細胞的增殖、分化和成熟，而且對其它的細胞，如抗原遞呈細胞、成纖維細胞、角質細胞、皮膚粘膜細胞等，均有著不同程度的刺激作用。GMCSF對某些疾病，如腫瘤患者放療、化療以后的白細胞減少癥、再生障礙性貧血和骨髓移植的治療有重要作用，以及在抗病素、抗真菌感染等的治療中也有良好的療效。1985年Sieff等發表了第一篇有關重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的文章后，這些年來有關rhGMCSF研究報道的文獻每年均在千篇左右。GMCSF是糖蛋白，相對分子質量為22000，基因定位在第5條染色體長臂上，基因約2.5kb，含有4個外顯子和3個內含子。其mRNA包括編碼成熟蛋白質的127個氨基酸殘基和信號肽的17個氨基酸殘基的密碼子。重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子產品1.人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的制備利用表達分泌型GMCSF工程菌W3100/pGMCSF可以表達具有天然結構和生物活性的GMCSF，表達量高，易于純化，無需復性，純化的GMCSF比活高于包含體型，但其發酵表達技術較難掌握。分泌型GMCSF工菌型W3100/pGMCSF發酵工藝發酵甘油保存菌劃平皿，挑取單菌落，接種于LB種子培養基中，18h，再擴大培養12h，接種于30L發酵罐，30℃培養，過程中流加50%的葡萄糖、酵母浸出液及酷素水解物。培養20h左右時開始表達，28h表達是高峰，之后細菌開始死亡，雜蛋白增加。培養過程中，尤其是對數期，用葡萄糖的加量來控制細菌生長速度，以免溶氧量下降過快。發酵產物為分泌型GMCSF，占菌體總蛋白的25%以上。發酵產物收集、純化離心離子交換層析或親和層析純化超濾濃縮，分子篩除菌過濾、分裝、凍干近年應用較多的還有融合蛋白表達GMCSF的方法。采用ＰＣＲ方法改建人粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子的ｃＤＮＡ，３′換用ＴＡＡ終止密碼，將其克隆入多種不同表達融合蛋白的載體中，并在ｃＤＮＡ與上游細菌蛋白基因之間嵌入凝血酶接頭，導入適當宿主后均獲得高效表達，表達融合蛋白經凝血酶消化后釋放出Ｎ－末端與天然成熟蛋白一級結構（糖基化除外）完全相同的ｒｈＧＭＣＳＦ，經層析純化可得到適宜人體應用的活性蛋白。2.質量控制標準和要求半成品檢定

主要包括下列項目：蛋白質含量測定，活性測定，比活性測定，相對分子質量測定，純度測定，核酸含量測定，鼠IgG含量測定，等電點測定，無菌試驗，熱原質等。成品檢定

主要包括下列項目：外觀檢查，活性測定，水分測定，無菌試驗，安全毒性試驗，熱原質試驗，肽圖測定等。三、人白細胞介素-2人白細胞介素-2（interleukin-2,IL-2）是由T淋巴細胞分泌的一種糖蛋白，為一種多肽類藥物，又稱T細胞生長因子。其在機體免疫應答中具有重要作用，是一種免疫增強劑，具有抗病毒、抗腫瘤及改善和提高機體免疫功能的作用。天然白介素-2由396個核苷酸加上起始密碼和終止密碼組成，編碼133個氨基酸，其中含有三個半胱氨酸（58、105和125位），第125位Cys的巰基游離，易引起IL-2分子內二硫鍵錯配或分子間二聚體的形成，從而降低IL-2的生物活性與穩定性，同時增加其不良反應。重組的未加改構的人白介素-2多以包含體形式表達，在變性與復性過程中易形成二硫鍵錯配，為進一步提純帶來困難。為解決上述問題，可將重組IL-2經過密碼子突變，將第125位的半胱氨酸改為丙氨酸。1.重組人白細胞介素-2重組人白細胞介素-2是通過反轉錄PCR技術從外周血單個核細胞中克隆到人的白細胞介素-2cDNA，再通過基因定點突變技術，針其第125位半胱氨酸的密碼子突變為丙氨酸或絲氨酸的密碼子，從而防止分子內二硫鍵的錯配或分子間二聚體的形成，增強藥物的穩定性與生物活性，減少不良反應。在臨床應用上與普通IL-2比較，改構體的活性增高，療效增強，半衰期延長，熱穩定性好，純度高，不良反應顯著減少。重組時利用定點突變方法將天然IL-2的第125位氨基酸由Cys改為Ala（密碼子由TGT變為GCT），獲得新型IL-2——

設計并人工合成兩條寡核苷酸引物：引物1：5’-AGC

AAT

TCCATGGCACCTACTTCAAGT-3’引物2：5’-ATGGATCC

TTATCAAGTCAGAGTCGAGATGATGCTTTGAGCAAAGGT-3’1.重組人白細胞介素-2工程菌的生產PCR擴增得到0.4kb大小的DNA片段，經鑒定為含Ala125突變的IL-2基因。PCR片段用EcoRⅠ-BamHⅠ雙酶切。將表達質粒pBV220同樣用EcoRⅠ-BamHⅠ酶切，并用T4DNA連接酶使之與PCR擴增的重組IL-2編碼基因連接，得到重組質料pBV220/IL-2。將重組質粒轉化大腸桿菌DH5α，得到Ala125IL-2的工程菌株。表達的Ala125IL-2可占菌體總蛋白的42.7%。超聲波裂菌離心收集包含體SephacrylS200凝膠過濾氧化劑復性透析除鹽獲得純品產品純HPLC分析鑒定，純度可達99%以上，用3H-TdR摻入法進行活性測定，比活性1×107U/mg，比野生型IL-2比活性平均提高30%。rhIL-2產品四、重組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)早在1940年，Hoftman等在腦和垂體的抽提物中發現一種能夠促進成纖維細胞生長的物質。1974年該物被分離純化，并命名為成纖維細胞生長因子（fibroblastgrowthfactor，FGF）。接著，人們又分離出一種與之高度同源的物質，由于它含有較多的酸性氨基酸堿基，等電點為酸性（5.6），故命名為酸性FGF（aFGF）。先發現的FGF因對酸和熱敏感，等電點呈堿性（9.6），則稱為堿性FGF（bFGF）。現今資料表明，bFGF的生物學作用極其廣泛，它在血管形成、促進創傷愈合與組織修復、促進組織再生和神經組織生長發育過程中起著十分重要的作用。bFGF是含155個氨基酸的促有絲分裂的陽離子多肽，其氨基酸序的55％和aFGF相同，分子量為16～18.5KD。bFGF分子結構中有4個半胱氨基酸，以此形成分子的三維空間結構。由絲氨酸取代半胱氨酸的重組bFGF的生物學活性不變，而單鏈多肽則易于在大腸桿菌中表達。bFGF基因位于人的第5對染色體上，為單拷貝基因，呈不連續狀態，其功能區被兩個內含子隔開分為三個外顯子區域。bFGF有很強的肝素親和力。bFGF基因中未發現信號肽順序，可經自分泌方式釋放。國內第二代基因重組h-bFGF也已經問世，并正式批準生產。rh-bFGF工程菌的載體多用PUC系列質粒，含有氨芐抗性、LAC啟動子，以大菌桿菌作為宿主。生產時使用IPTG誘導表達，rh-bFGF可分泌至胞漿中，采用連續流加葡萄糖的高密度分批發酵工藝，經11h后可獲得產量達200mg/L的bFGF，經親和層析（多用肝素親和）純化后可獲得高純度的bFGF，其理化及生物學特點符合藥用要求。五、重組人超氧化物歧化酶（rh-SOD）SOD是一種生物高效抗氧劑，能特異性消除氧自由基。而rh-SOD不僅僅在類風濕關節炎、心血管等疾病上有獨到之處，還廣泛應用于保健品、化妝品領域，天然SOD制品是從牦牛血液中提取的，主要以紅細胞為起始材料，投資大、能耗高、收率低、成本高，價錢十分昂貴。基因工程的方法：從胎肝中獲取微量rh-SOD后，RT-PCR得到SODcDNA，在大腸桿菌中克隆表達，并通過rh-SOD工程菌的發酵、純化的研制，在模擬生產條件下進行中試工藝放大，純化后得到rh-SOD產品。將含有人體SOD基因的PCR252載體的大腸桿菌接種子培養基中，在32℃的溫度下，發酵培養24小時，再加入占發酵液重量1％的硫酸銅清液，再向發酵液加入3倍體積的去離子水，用震動式破碎機劇烈震動破碎30min，靜置20min，置入每分鐘