第二章基因工程工具酶工具酶

-----DNA分子的切割和連接技術。

Smith發現了第一個Ⅱ型限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease，RE)對DNA分子有特異地切割作用。（手術刀剪）

Khorana又發現了T4DNA連接酶（Ligase），能將DNA片段連接在一起。（縫紉機、漿糊）

DNA、RNA聚合酶和反轉錄酶等合成酶。（復印機）

構成了一個研究DNA、RNA分子的工具酶箱。第一節限制性核酸內切酶

限制性核酸內切酶是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結構的核酸內切酶。一、宿主的限制和修飾現象----發現

1952～1953年在T偶數噬菌體和λ噬菌體對大腸桿菌的感染實驗中研究者發現了細菌的限制和修飾現象。正是對限制和修飾現象的深入研究，導致限制性內切核酸酶的發現。

寄主控制的限制與修飾現象由兩種酶活性配合完成的，一種叫修飾的甲基轉移酶，另一種叫核酸內切限制酶。寄主控制的限制與修飾的作用，一是保護自身的DNA不受限制；二是破壞外源DNA使之迅速降解。

根據限制-修飾現象發現的核酸內切限制酶，現在已成為重組DNA技術學的重要工具酶。純化后的限制性內切酶允許分子生物學家以一種精確的可重復的方式切割基因克隆所需的DNA分子。這些酶的發現是基因工程發展過程中的一項突破性進展。二、限制性核酸內切酶的類型

根據其識別和切割序列的特性、催化條件及修飾活性等，一般將限制酶分為I，Ⅱ，Ⅲ三大類。

I類：不適用于基因工程。只在腸道菌中發現。

Ⅱ類：基因工程的工具酶。

Ⅲ類：切割位點不在識別位點，一般離識別位點24bp～26bp，對分子克隆操作亦無實用意義。已有超過1200種。性質

I型限制性核酸內切酶蛋白質結構和功能由3個亞基組成的復合功能酶；α內切酶活性，β甲基化酶活性，γ特異性識別序列識別部位不對稱序列AACN6GTGC切割部位非特異性，距識別部位大于1000bp限制作用所需的輔助因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸性質

Ⅲ型限制性核酸內切酶蛋白質結構和功能由2個亞基組成的雙功能酶；M亞基位點識別與修飾，R亞基內切活性識別部位5-7bp的不對稱序列切割部位非特異性，距識別部位一側24-26bp限制作用所需的輔助因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸性質Ⅱ型限制性核酸內切酶蛋白質結構和功能獨立的內切酶和甲基化酶識別部位短小的回文序列（多數4-6bp）切割部位同于或接近于識別部位限制作用所需的輔助因子Mg2+三、限制性核酸內切酶的命名

H.D.Smith等于1973年提議的命名系統。名稱的第個1字母取自它來源細菌屬名的第1個字母，大寫；第2，3二個字母取自它來源細菌的種名的頭2個字母，小寫；如果它的來源菌還有株系，則有第4個字母；若酶的編碼基因位于噬菌體或質粒上，則用一個大寫字母表示此染色體外的遺傳成分；最后用大寫羅馬數字，代表同一菌株中不同限制酶的編號。前三個字母用斜體表示。

第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發現的先后次序。命名Hin

dⅢ

屬

種

株序Haemophilus

influenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶所有的限制酶，除了以上名稱外，前面還冠以系統名稱內切酶系統名稱R；甲基化酶系統名稱M。例如R.HindⅢ，表示內切酶

M.HindⅢ，表示甲基化酶但現在限制性內切酶名稱中的R省略不寫。通常情況下，需要對克隆的DNA進行切割。首先，如果以克隆單個基因為目的，該單個基因可能僅僅包含2-3kbDNA，則這個基因不得不從大的(通常情況下超過80kb)DNA分子中切割出來。其次，大的DNA分子不得不被切斷成小的足以被載體攜帶的片段。絕大多數克隆載體能夠承載的DNA片段處于一個特定的大小范圍中。比如，以M13噬菌體為基礎的載體，所克隆的DNA分子超過3kb時運載效率非常低。四、Ⅱ型限制性核酸內切酶的基本特征

Ⅱ型限制性核酸內切酶的基本特性識別雙鏈DNA分子中4--8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內部或兩側識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構(palindrome)

。

GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口切口

：平端切口、粘端切口5’粘端切口GAATTCCTTAAG

EcoRⅠGCTTAAAATTCGCTCGAGGAGCTCCTCGAGGAGCTC

PstⅠ3’粘端切口DNA分子中識別序列的出現頻率對特定的限制性內切酶來說，在已知長度的DNA分子中,識別序列的數量能夠通過數學方法計算出來。這一算法假定核苷酸以一種隨機方式排列而4個不同核苷酸以相同的比例出現(例如GC含量：50％)。一個四核苷酸序列(如GATC的酶)每44=256個核苷酸出現一次。實際上，這些假設不可能完全有效。如，λDNA分子，49kb，GC的含量要少于50％。對一個六核苷酸識別序列的限制性內切酶來說應該具有12個酶切位點。實際上，這些識別位點發生的頻率要小一些，如：BglⅡ有6個，

BamHI有5個，

SalI則只有2個。同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAG

GATCCG++ATCTAG

GATCTA五、限制性內切酶的酶切反應條件1.為內切酶提供一個合適的環境(buffer)。所有限制性內切酶Ⅱ都需要在鎂離子存在下才發揮作用。離子強度通常由氯化鈉(NaCl)提供。絕大多數限制性內切酶的最適pH在7.4左右。不當的環境，不僅會降低限制性內切酶的活性，還會導致酶的專一性的改變，使DNA切割額外的、非標準的識別序列。2.限制性內切酶的用量供應商提供純的已知濃度的溶液。1個酶單位：被定義為在合適的溫度與緩沖液中，在20μL反應體系中，1h完全切割1μgDNA所需要的酶量。對于大量DNA的酶解，反應體積可按比例擴大，加入過量的酶（2～5倍）和較長的反應時間。3.反應溫度：絕大多數，37℃時活性達到最大；一小部分需要不同的工作溫度，如SamⅠ酶消化時，25℃才能達到酶的最大活性。BacⅠ酶消化時，50℃才能達到酶的最大活性。

4.酶解過程：

酶解體系的確定；成分的混勻；酶切反應；終止反應。

終止反應的方法：

如果酶切下來的DNA片段用于克隆實驗，則反應中的酶應該消除掉以保證它不會意外地消化掉那些將在以后步驟中加入的其他DNA分子。“消滅”酶：

70℃保存很短的一段時間；苯酚抽提;

加入EDTA(鰲和Mg2+)或加入SDS使酶變性。5.限制性內切酶的酶切結果鑒定6.內切酶對DNA分子的不完全酶解：

完全酶切消化作用。

不完全酶切消化作用（構建基因組物理圖譜、基因組文庫及片段連接）。減少酶量，增加反應體系，縮短反應時間。六、影響限制性內切酶的活性的因素酶的純度DNA樣本的純度DNA甲基化的程度酶切反應的溫度和時間DNA的分子構型內切酶的緩沖液

如果內切酶處于非最適的反應條件下其識別序列位點有時會發生改變，這時產生錯誤切割的能力叫內切酶的星活性。高甘油含量內切酶用量過大低離子強度高pH值含有機溶劑Mn2+、Cu2+、Zn2+等非Mg2+的二價陽離子存在。第二節DNA連接酶DNA連接酶的基本性質修復雙鏈DNA上切口處的磷酸二酯鍵。DNA連接酶OHP5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick3‘…

C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C

…5’5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’OHPds-DNA結構:切口,缺口,斷口缺口(gap)切口(nick)斷口(cut)3'HOP5'3'HOP5'5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

T4-DNA連接酶DNA連接酶的基本性質連接多個平頭雙鏈DNA分子。DNA連接酶連接作用的分子機理連接酶與輔助因子ATP（或NAD+）提供的激活AMP形成一共價結合的酶－AMP復合物（腺苷酰酶）。同時釋放出焦磷酸（Ppi）[或煙酰胺單核苷酸（NMN）]。激活的AMP從賴氨酸殘基轉移到DNA一條鏈的5’－末端磷酸基團上形成DNA－腺苷酸復合物。3’－OH末端對活躍的磷原子作親核攻擊，形成磷酸二酯鍵將缺口封起來，同時釋放出AMP。3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’OHPT4DNA連接酶ATP酶-AMP+PPi大腸桿菌連接酶NAD+酶-AMP+NMN酶3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’OHPAPDNA連接酶的反應條件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mM(不能大于1mM)DTTVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應條件下15℃反應1小時，完全連接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量1U酶已經足夠DNA連接酶的種類T4噬菌體DNA連接酶分子量68Ku。是噬菌體基因30編碼的產物，需要ATP作為輔助因子。應用最廣。大腸桿菌DNA連接酶分子量75Ku。是大腸桿菌基因組中的lig

基因編碼的產物，需要ATP作為輔助因子。不能連接平末端的兩端片段。假陽性背景低。影響連接反應的因素溫度

酶最佳反應溫度37℃，在此溫度下粘性末端之間氫鍵結合是不穩定的。連接反應最佳溫度需介于兩者之間。DNA末端的濃度

兩個DNA末端間的連接可認為是雙分子反應，標準反應條件下，其反應速率完全由相互匹配的DNA末端濃度決定。線性分子；環狀分子重組子的構型與DNA濃度及DNA分子長度存在密切關系。小分子DNA片段易于分子內連接；較長DNA片段濃度降低有利于分子環化，濃度增加利于分子間連接。平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動力學的角度講，由限制性核酸內切酶創造的粘性末端的連接屬于分子內部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應速度要慢得多提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會

加入10%PEG8000，促進大分子之間的有效作用加入單價陽離子（NaCl），最終濃度150-200mM第三節DNA聚合酶DNA聚合酶（DNApolymerase）

能在引物和模板的存在下，把脫氧核糖單核苷酸連續的加到雙鏈DNA分子引物鏈的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。DNA聚合酶的分類

依據聚合酶使用的模板不同，將其分為兩類：依賴于DNA的DNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ(pol

Ⅰ)生物活性５’→３’ＤＮＡ聚活酶活性５’→３’外切酶活性３’→５’外切酶活性置換活性用途

５’ＣＣＧ-ＯＨ３’３’ＧＧＣＴＡＴＣＧＡ５’↓Mg2+

↓dNTPs

↓polⅠ↓５’ＣＣＧＡＴAGＣＴ３’３’ＧＧＣＴＡＴＣＧＡ５’５＇ＣＧＣＡＴＣＴ３＇３＇ＧＣＧＣＧＴＡＧＡ５＇↓↓Ｍg2＋↓polⅠ↓

５＇ＣＡＴＣＴ３＇３＇ＧＣＧＣＧＴＡＧＡ５＇＋５＇pＣ＋５＇pＧ５＇ＣＧＣＡＣＴ３＇３＇ＧＣＧ５＇↓Ｍg2＋↓polⅠ↓↓５＇ＣＧＣ-ＯＨ３＇３＇ＧＣＧ-p５＇＋５＇pＡ＋５＇pＣ＋５＇pＴ

dNTPs

抑制５＇Ｃ-Ｇ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ３＇３＇Ｇ-Ｃ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ５＇↓↓DNase

Ⅰ５＇Ｃ-Ｇ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ３＇３＇Ｇ-Ｃ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ５＇↓

↓Ｍg2＋,

polⅠ,＊

dNTP↓５＇Ｃ-Ｇ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ３＇３＇Ｇ-Ｃ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ５＇５’→３’外切酶活性ＤＮＡ聚活酶活性用途

用切口平移方法標記ＤＮＡ用于cＤＮＡ克隆中合成第二鏈用于對ＤＮＡ分子的３’突出尾進行末端標記

大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow

）Klenow酶的基本性質：大腸桿菌DNA聚合酶I經枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。

Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。Klenow片段

補平限制酶切割ＤＮＡ產生的３’凹端用〔３２Ｐ〕dＮＴＰ補平３’凹端，對ＤＮＡ片段進行末端標記對帶３’突出端的ＤＮＡ進行末端標記在cＤＮＡ克隆中，用于合成cＤＮＡ第二鏈在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈ＤＮＡ應用Ｓanger雙脫氧末端終止法進行ＤＮＡ測序消化限制酶產生的３’突出端應用于ＰＣＲ技術Ｔ４噬菌體ＤＮＡ聚合酶

生物活性５'→３'ＤＮＡ聚合酶活性3'→5'外切核酸酶活性交換（置換）反應用途

5‘CCGOH3'

3'GGCTACGA5'↓↓Mg＋＋↓T4DNA聚合酶↓dNTPs5'CCGATGCT3'3'GGCTACGA5'

5'CGCATCT3'

3'GCG5'

↓↓Mg＋＋↓T4DNA聚合酶↓5'CGCOH3'3'GCG5'

+

5'pA

+

5'pC

+

5'pT

5'CGTCGCOH3'

3'GCAGCG5'

↓↓Mg＋＋↓T4DNA聚合酶↓[α-32P]dTTP5'CGOH3'3'GCAGCG5'↓↓5'CGT*OH3'

3'GCAGCG5'

補平或標記限制酶消化ＤＮＡ后產生的３'凹端對帶有３'突出端的ＤＮＡ分子進行末端標記標記用作探針的ＤＮＡ片段將雙鏈ＤＮＡ的末端轉化成平端使結合于單鏈ＤＮＡ模板上的誘變寡核苷酸引物得到延伸TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶是一種耐熱的依賴于DNA的DAN聚合酶，最初從極度嗜熱的水生菌中純化而來。它具有2種活性，需Mg2+作輔助因子。５’→３’DNA聚合酶活性；５’→３’外切核酸酶活性。主要應用于PCR反應。逆轉錄酶

禽源逆轉錄酶和鼠源逆轉錄酶生物活性５'→３'ＤＮＡ聚合酶活性ＲＮＡ酶Ｈ活性用途

類型性質

禽源逆轉錄酶鼠源逆轉錄酶來源

來自純化的禽成髓細胞瘤病毒(AMV)從一株能表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)反轉酶基因的大腸桿菌中發離得到的

肽鏈

兩條多肽鏈

單鏈多肽

生物活性

無３'→５'外切核酸酶活性、聚合酶活性、強的ＲＮＡ酶Ｈ活性

無３'→５'外切核酸酶活性、聚合酶活性、弱的ＲＮＡ酶Ｈ活性

pＨ值

８．３７．６

５'→３'ＤＮＡ聚合酶活性

5'T

T

T

T

TOH3'3'AAAAAUCUGUCCUA5'↓↓Mg＋＋↓dNTPs↓逆轉錄酶

5'T

T

T

T

TAGACAGGAT3'

3'AAAAAUCUGUCCUA5'

ＲＮＡ酶Ｈ活性

RNA----5'UCCGUA3'

DNA----3'AGGCAT5'

↓逆轉錄酶↓

5'UC3'

3'AGGCAT5'

+

5'CGUA3'用途

逆轉錄酶主要用于將ｍＲＮＡ轉錄成雙鏈ｃＤＮＡ在此反應中可用３種類型的引物：寡脫氧胸苷酸[12-18]聚體,oligodt特定序列的寡核苷酸標記帶５'突出端的ＤＮＡ片段可用于雙脫氧鏈終止法測序

DNA和RNA的修飾酶

末端脫氧核苷酸轉移酶（terminaldeoxynucleotidyl

transf