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蒞臨指導肺泡表面活性物質研究生:鐘紅平

導師:教授主要內容1.選題的目的2.選題的理論和實際意義7.目前進展情況3.主要研究內容5.主要研究方法4.主要技術路線6.預期結果選題目的本課題以RDS大白鼠模型和健康大白鼠通過檢測KLF2轉錄因子和KLF2mRNA在大白鼠肺組織表達以及RDS大鼠甲狀腺素水平的變化的研究，確立甲狀腺素和KLF2對肺泡Ⅰ型細胞功能調控以及在RDS發病中所起的作用和機制，提出了在對肺表面活性物質治療不敏感的NRDS中一種新型的治療選擇,為早期給NRDS患兒甲狀腺素替代治療提供理論依據。選題的理論和意義

新生兒呼吸窘迫綜合癥（NeonatalrespiratorydistresssyndromeNRDS)是新生兒早期死亡的重要原因，臨床特點為出生后不久即出現進行性呼吸困難、青紫、呼氣性呻吟、吸氣性三凹征和呼吸衰竭。本病由于早產兒肺結構不成熟、缺乏肺表面活性物質(PS)引起。病理特征為肺泡壁至終末細支氣管壁上廣泛嗜伊紅透明膜形成并肺不張，若不治療,可發生進行性低氧血癥和呼吸衰竭,甚至死亡【1】。NRDS不僅容易發生在早產兒，而且選擇性剖宮產足月新生兒也容易發生，目前對NRDS的治療主要是采用補充外源性的PS聯合機械通氣治療，外源性的PS價格非常昂貴。但值得注意的是約20％至30％NRDS的患兒對表面活性劑替代療法不敏感【2】，尤其是胎齡越小的早產兒由于肺泡結構發育不成熟，對外源性表面活性劑無反應，建立成功的治療方案往往因對NRDS的發生、發展的認識而受到很大的限制。因此進一步了解NRDS的發病機制和對外源性表面活性劑無反應機理是十分重要的。目前對于NRDS的發病機制主要集中在肺泡Ⅱ細胞功能上，近年來對NRDS的認識逐步發展到對肺泡整體細胞功能的調控上，尤其是肺泡Ⅰ型細胞的功能調控越來越受到重視。如何調控肺泡Ⅰ型細胞的功能是目前的研究熱點。肺泡I型上皮細胞的功能在NRDS的發病機制中起重要的作用。國內外經過長期的研究證明【3-5】I型肺泡細胞負責進行氣體交換，Ⅱ型肺泡細胞產生PS，降低肺表面張力。糖皮質激素和他們的同源受體已經很早被知道可以促進Ⅱ型肺泡的成熟，來協調PS的產生。產前孕母糖皮質激素的預防應用和新生兒外源性的PS替代治療作用還是不能降低NRDS的發生和改善部分NRDS的癥狀，所以目前提出只有I型和II型肺泡細胞功能協調，相互調節平衡才能保證肺泡的擴張和有效的氣體交換。但是對于I型肺泡通路控制的細胞介導的氣體交換卻知之甚少。

LimingPei等【2】在小鼠的研究中發現SMRT的突變從而導致1型肺泡的早熟，出現一種新型的RDS，盡管對糖皮質激素反應不敏感，但是聯合應用抗甲狀腺激素類藥物完全可以減少SMRT引起的NRDS，表明甲狀腺激素受體（hormonereceptorTR）在肺發育中的重要作用還沒有被認識到。甲狀腺激素與甲狀腺激素受體作用形成TR-SMRI復合物，激活下游Krüppel樣鋅指轉錄因子(Krüppel-liketranscriptionfac-tors,KLFs)中的

KLF2因子，促進肺泡Ⅰ型細胞的分化和成熟，沒有KLF2的小鼠會缺乏成熟1型肺泡，最終導致小鼠在生后很短時間內死亡。死亡的RDS的幼崽和它們同窩出生仔畜相比，肺內KLF2mRNA和蛋白水平較低，組織學檢查發現RDS幼崽出現肺不張，并且有很少典型I型肺泡的扁平細胞，但是有豐富的立方形Ⅱ型樣細胞，免疫組織化學顯示在他們的肺中I型標記物蛋白顯著減少，從SP-B，SP-C和PECAM-1染色判定Ⅱ型肺細胞和血管內皮細胞并沒有受到影響，這些結果表明，KLF2在I型肺泡的分化和體內正常的肺發育中是必不可少的。進一步研究KLFs是Spl/Krüppel樣轉錄因子(Spl-likeandKrüppel-liketranscriptionfactors,Spl/KLFs)家族中的一個亞家族【6】。在哺乳動物中,KLFs可調控細胞增殖、遷移、凋亡和分化等,它們對早期胚胎發育也至關重要。Krüppel樣轉錄因子2(Kruppel-likefactor2KLF2),是當前研究的熱點，由于最初被發現主要在肺內高表達，因此也被稱為肺Krüppel樣轉錄因子(LKLF)【7】對肺的發育起關鍵性作用。甲狀腺激素受體和KLF2是I型肺泡細胞分化、成熟的重要受體和因子，國內外對此的研究剛剛開始，還未涉及它們與NRDS的相互關系，甲狀腺激素水平和NRDS的相關性研究很少。主要研究內容（2）通過對移植模型中治療組與模型對照組腫瘤體積變化、腫瘤重量變化及正常組與模型對照組、各治療組之間胸腺指數與脾指數的變化，研究參雄抗癌丸的作用機制。

（3）本實驗采用腫瘤組織HE常規染色，從形態學上觀察各組間腫瘤細胞密度，腫瘤壞死程度（1）動物移植性腫瘤模型的成功制備（4）用流式細胞儀檢測各組的腫瘤細胞凋亡率；用免疫組化技術觀察該藥物對腫瘤組織VEGF及MVD表達的實驗影響（5）

本項研究采用腹腔種植H22瘤株制造肝癌模型，通過動物實驗研究參雄抗癌丸對荷瘤鼠VEGF及MVD表達的實驗影響，從分子水平探討參雄抗癌丸對腫瘤的影響機制。從而為該藥提供技術支持，并為其產品開發和走向市場提供理論依據。主要技術路線選購SPF級小鼠動物造模及分組參雄抗癌丸高劑量組參雄抗癌丸中劑量組參雄抗癌丸低劑量組5-FU組模型對照組正常組給藥、標本采集和處理檢測：1肉眼觀察2抑瘤率的測定3HE常規染色4細胞凋亡率及細胞周期的測定5免疫組化檢測VEGF和MVD

統計數據，得出實驗結果，撰寫論文主要研究方法1.實驗材料1)瘤株H22北京藥物研究所引進，甘肅醫學科學院傳代保種。2）實驗藥品參雄抗癌丸由甘肅省醫學科學研究院制成水蜜丸劑，每包2克；5-FU注射液3）實驗動物

SPF級昆明小鼠，雌雄各半，體重18～20g,5～6w齡，由甘肅省中醫學院動物實驗中心提供2.實驗方法：（1）造模：從H22瘤株傳代小鼠的腹腔抽取乳白色的瘤液，用生理鹽水稀釋至瘤細胞計數為2×106個/ml，胎盤藍染色證實活細胞數達到96%，將瘤細胞懸液注射到小鼠右前肢腋窩部皮下0.2ml／只，接種的瘤細胞數約為5×106個／只。均在無菌條件下進行（2）動物分組及給藥方法:接種次日，將除正常組外的80只小鼠隨機分為5組:A組為模型對照組，每日用蒸餾水灌胃；B組為陽性對照組，每天5-FU10㎎/kg腹腔注射；C組為藥物高劑量組1560㎎/kg灌胃。D組為藥物中劑量組780㎎/kg灌胃。E組為藥物低劑量組390㎎/kg灌胃。每天一次，連續灌胃10天。(4)標本采集及處理：實驗結束后第二天，將禁食12小時的所有實驗動物脫頸處死取脾臟、胸腺和瘤組織。3.觀察指標（2）計算相關免疫器官指數及抑瘤率分別按以下公式計算脾指數、胸腺指數和抑瘤率（單位：mg/l0g）胸腺指數=胸腺重量（mg）/體重(g)脾指數=脾臟重量（mg）/體重(g)（3）抑瘤率完整剝離腫瘤,用1/1000電子天平稱取瘤重。抑瘤率(%)=(1-T/C)×100%,(T/C:治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)。（4）病理形態學觀察瘤組織塊以4﹪甲醛固定，石蠟包埋，切片，經HE染色，光學顯微鏡下觀察瘤組織病理變化（1）造模后，觀察各組小鼠局部瘤組織情況，小鼠活動、進食、精神狀態等情況。（（5）細胞凋亡率的測定

根據試劑盒上的說明書具體步驟進行（6）標本切取:停藥次日小鼠頸椎脫臼處死，完整剝離腫瘤，10﹪中性緩沖福爾馬林固定，常規石蠟包埋，石蠟切片厚5um。各組計量資料輸入計算機，采用SPSS16.0forwindows統計軟件包，以平均值士標準差(X士S)表示，各組間的比較采用單因素方差分析。統計學處理

參雄抗癌丸對荷瘤小鼠的腫瘤生長有抑制作用，治療后抑瘤率較模型組有顯著差異

參雄抗癌丸可提高腫瘤細胞的凋亡率，具有促進或誘導腫瘤細胞發生凋亡的作用。參雄抗癌丸可抑制肝癌組織VEGF的表達水平，同時降低肝癌組織MVD。（各治療組的MVD和VEGF水平與病理模型組比較均有明顯的下降。）

預期結果目前進展情況目前已完成文獻檢索經費預算1.材料購置費2000元2.試劑購置費3000元3.檢測勞務費2500元4.文獻檢索費200元5.論文打印及版面發表1500元6.論文答辯1500元

共計：10700元實驗經費為研究生科研經費研究進度及具體時間安排2007年12月---2008年2月撰寫開題報告2008年3月---2008年5月