SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity1單基因遺傳性疾病的分子診斷

溫州醫科大學檢驗醫學院、生命科學學院SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity2

遺傳性疾病主要分為兩大類：符合孟德爾遺傳規律的單基因遺傳病(特點:病種多、在特定家系中發病率高、對群體的影響小)不符合孟德爾遺傳規律的多基因遺傳病（又稱多因素性疾病，特點：病種相對較少、不僅在特定家系中發病率高、而且對群體的影響大）SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity3單基因遺傳病是指受一對等位基因控制的遺傳病，有6600多種，并且每年在以10-50種的速度遞增，單基因遺傳病已經對人類健康構成了較大的威脅。較常見的有紅綠色盲、血友病、白化病等。

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity4單基因遺傳病常染色體顯性遺傳病常染色體隱性遺傳病X連鎖顯性遺傳病X連鎖隱性遺傳病Y連鎖遺傳病SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity5常染色體顯性遺傳病位于常染色體上的兩個等位基因中，如有一個突變，這個突變基因的異常效應就能顯示發病。特點：遺傳與性別無關，男女發病機會均等；患者雙親往往有一方為患者。家族性多發性結腸息肉、多指、并指等。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity6常染色體隱性遺傳病致病基因為位于常染色體上的隱性基因，當隱性基因純合時才能發病。即隱性遺傳病

單基因遺傳病患者，大多是由兩個攜帶者所生的后代。特點：男女發病機會均等，發病與性別無關；雙親為無病攜帶者，子女發病概率為25%；常是越代遺傳；近親婚配時，子女中隱性遺傳病患病率大為增高。先天性聾啞、白化病、苯丙酮尿癥等。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity7X連鎖顯性遺傳病特點：女性發病率高，這是由于女性有兩條X染色體，獲得這一顯性致病基因的概率高之故，但病情較男性輕。男性患者病情重，他的全部女兒都將患病。抗維生素D佝僂病、家族性遺傳性腎炎等。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity8X連鎖隱性遺傳病特點：女性攜帶，男性患病。男性的致病基因只能隨著X染色體傳給女兒，不能傳給兒子，稱為交叉遺傳。血友病A。病因：血漿中抗血友病球蛋白減少，AHG即第Ⅷ因子凝血時間延長。臨床表現：輕微創傷即出血不止，不出血時與常人無異。血友病B。病因：血漿中缺乏凝血酶成份PTC，即第Ⅸ因子。臨床表現同血友病A。色盲。臨床表現：全色盲對所有顏色看成無色，紅綠色盲為不能區別紅色和綠色。進行性肌營養不良。病因：為原發性橫紋肌變性并進行性發展。臨床表現：初為行走笨拙，易跌到，登梯及起立時有困難，從仰臥到起立必須先俯臥，雙手撐地，再用兩手扶小腿、大腿才能站起。進行性肌肉萎縮，但一般不累及面部及手部肌肉。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity9Y連鎖遺傳病Y連鎖遺傳病的特點是男性傳遞給兒子，女性不發病。因Y染色體上主要有男性決定因子方面的基因，其他基因很少，故Y連鎖遺傳病極少見。目前已經知道的Y伴性遺傳的性狀或遺傳病比較少，肯定的有H－Y抗原基因、外耳道多毛基因和睪丸決定因子基因等。

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遺傳病的診斷方法可以簡單的分為以下的四類：1.分子水平的診斷：包括限制性片段長度多態性的酶切分析、基因型和單體型的連鎖和關聯分析、基因的序列分析。2.細胞水平的診斷：采用細胞遺傳學技術進行染色體核型分析，比如熒光原位雜交法。3.蛋白質水平的診斷：采用生物化學方法分析異常表達的蛋白質或代謝產物。4.疾病動物模型的輔助診斷：建立相應的轉基因疾病動物模型，輔助診斷或判定人類疾病的致病基因。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity11所有遺傳性疾病都與某種或多種基因的突變有關，對這類疾病進行分子診斷有兩種策略可供選擇：

1.直接診斷策略；

2.間接診斷策略SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity12遺傳性疾病分子診斷的直接策略就是通過各種分子生物學技術直接檢測導致遺傳性疾病的各種基因突變，如基因的缺失、插入、倍增或者是點突變等遺傳缺陷。因此直接診斷的前提是被測基因已經克隆，其核酸序列和結構已被闡明。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity131、點突變的診斷直接診斷策略和方法：直接檢測基因點突變：等位基因特異性寡核苷酸雜交（ASO）、PCR－ELISA、等位基因特異性擴增（ASA）、PCR－RFLP、基因芯片技術等；基因背景未知的點突變：單鏈構象多態性（SSCP）、變性梯度凝膠電泳（DEEG）、異源雙鏈分析（HA）、DNA序列測定、蛋白截短測試等。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity14

2、片段性突變的檢測

片段性突變是指DNA分子中較大范圍的堿基發生突變，如堿基的缺失、插入、擴增和重組。對于少數核苷酸缺失或插入，可以采用檢測點突變的方法，而對于大的片段突變，則使用Southern印跡技術和多重PCR技術。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity15間接診斷策略和方法：采用多態性連鎖分析的方法，尋找具有基因缺陷的染色體、相關基因的等位基因型和單倍體型等，并判定被檢者是否有這條存在基因缺陷的染色體、相關基因的等位基因型和單倍體型等。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity16《醫療機構臨床檢驗項目目錄（2013年版）》檢驗項目1462項：一、臨床體液、血液專業（360項）二、臨床化學檢驗專業（347項）三、臨床免疫、血清學專業（458項）四、臨床微生物學專業（152項）五、臨床分子生物學及細胞遺傳學檢驗（145項）SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity17五、臨床分子生物學及細胞遺傳學檢驗1、感染性疾病分子生物學檢驗（89項）2、疾病相關分子生物學及細胞遺傳學檢驗（25項）3、腫瘤分子生物學檢驗（17項）4、用藥指導的分子生物學檢驗（10項）5、其它（4項）SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity182、疾病相關分子生物學及細胞遺傳學檢驗染色體核型分析染色體熒光原位雜交分析脆性X染色體核型分析羊水細胞染色體分析高分辨染色體核型分析絨毛組織染色體分析姐妹染色體互換分析染色體分析21三體和性染色體多倍體檢測單基因遺傳病基因突變檢測遺傳性肌營養不良基因分析α地中海貧血基因突變檢測肝豆狀核變性基因分析β地中海貧血基因突變檢測血友病基因分析苯丙酮尿癥的基因突變檢測脆性X綜合癥基因分析遺傳性耳聾基因檢測Y染色體性別基因分析HLA低分辨基因分型檢測脫氧核糖核酸倍體分析HLA中分辨基因分型檢測血細胞熒光原位雜交分析HLA高分辨基因分型檢測未經處理的羊水細胞熒光原位雜交分析

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity19主要內容血紅蛋白病杜氏肌營養不良癥血友病苯丙酮酸尿癥成年型多囊腎SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity20導致單基因病產生的基因突變類型基因突變點突變密碼子插入或缺失移碼突變外顯子缺失或重復基因倒位基因融合動態突變SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity21針對單基因病基因突變的分子診斷技術DNA雜交基因酶譜連鎖分析寡核苷酸探針雜交PCR基因芯片DNA測序SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity22分子診斷的時機癥狀前診斷產前診斷著床前診斷癥狀后診斷SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity23

一、血紅蛋白病血紅蛋白的構成：2條α珠蛋白（141aa）和2條β珠蛋白（146aa）SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity24（一）珠蛋白基因簇的結構α珠蛋白基因簇：16Pter-p13.3

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity25β珠蛋白基因簇：11p15.5

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity26（二）鐮狀細胞貧血癥的分子診斷鐮狀細胞貧血是一種常染色體顯性遺傳血紅蛋白(Hb)病。臨床表現為慢性溶血性貧血、易感染和再發性疼痛危象以致慢性局部缺血導致器官組織損害。也是嚴重危害母子健康的疾病,可使胎兒死亡率達5%，孕婦死亡率達4.62%

。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity27因β-肽鏈第6位氨基酸谷氨酸被纈氨酸所代替，構成鐮狀血紅蛋白(HbS)，取代了正常Hb(HbA)。在氧分壓下降時HbS分子間相互作用，成為溶解度很低的螺旋形多聚體，使紅細胞扭曲成鐮狀細胞（鐮變）。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity28純合子型：SS，完全沒有正常的HbA,預后嚴重，只有14%活到成年，而多死亡于30歲前。雜合子型：AS，即正常HbA與異常HbS相混。在非洲有35%的病人是AS型基因；其變化懸殊，輕者可活至成年，重者可反復出現危象發作。

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity29病因：β珠蛋白基因點突變βA…CCTGAGGAG…βS…CCTGTGGAG…SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity30鐮狀細胞貧血的分子診斷方法Mst

IICCTGAGGCCTG

TGG突變型野生型1.15kb0.2kb1.35kbSchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity31限制酶切片段電泳后，經SouthernBlot檢測1.35kb1.15kb0.2kbSchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity32（三）地中海貧血的分子診斷地中海貧血又稱海洋性貧血、珠蛋白生成障礙性貧血，是一組遺傳性溶血性貧血疾病。由于遺傳的基因缺陷致使血紅蛋白中一種或一種以上珠蛋白鏈合成缺如或不足所導致的貧血或病理狀態。本病廣泛分布于世界許多地區，東南亞即為高發區之一。我國廣東、廣西、四川多見，長江以南各省區有散發病例，北方則少見。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity33根據所缺乏的珠蛋白鏈種類及缺乏程度予以命名和分類。分為α型、β型、δβ型和δ型4種，其中以β和α地中海貧血較為常見。

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity34α地中海貧血：大多數是由于α珠蛋白基因的缺失所致，少數由基因點突變造成。

各種表型的α地中海貧血的基因型表型基因型正常人αα/αα靜止型α地中海貧血α—/αα標準型α地中海貧血—

—/ααHbH病（β4）α—/—

—HbBart’s（胎兒水腫綜合癥，γ4）—

—/—

—ζψζψα2ψα1α2α1θ1SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity35基因突變：缺失為主遺傳方式：不完全顯性遺傳？--/αα

--/αα--/--SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity36α地中海貧血的基因診斷BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobeα基因簇限制性酶切片段和分子雜交探針SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity37限制酶切片段電泳后，經SouthernBlot檢測14kb10kbaa/aaaa/a-aa/--a-/----/--SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity38β地中海貧血：主要是由于基因的點突變，少數為基因缺失。

LCRεGγAγψβ1δβIVS-IIVS-IIβ基因簇和β基因的結構SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity39基因缺失和有些點突變可致β鏈的生成完全受抑制，稱為β0地貧；有些點突變使β鏈的生成部分受抑制，則稱為β+地貧。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity40β地貧基因突變較多，迄今已發現的突變點達100多種，國內已發現28種。其中常見的突變有6種：①β41-42（-TCTT)，約占45%；②IVS-Ⅱ654(C→T)，約占24%；③β17(A→T)；約占14%；④TATA盒-28(A→T)，約占9%；⑤β71-72（+A),約占2%；⑥β26(G→A)，即HbE26，約占2%。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity41

突變類型

分子缺陷

人群1．核苷酸取代(1)β-28核苷酸A→CTATA區轉錄信號突變，β+中國人(2)βIVS-1第1核苷酸G→A拼接接頭突變，導致RNA加工缺陷，β0地中海地區人(3)βIVS-1第5核苷酸G→C共有順序突變導致RNA加工缺陷，β+印第安人(4)βIVS-2第654核苷酸C→T內含子變化導致RNA加工缺陷，β0中國人(5)β第17密碼子A→T無義突變導致無功能RNA，β0中國人(6)HbKnossos(β27丙→絲)編碼區突變導致RNA加工缺陷，β+地中海地區人2．

核苷酸插入β密碼子71-72間插入1bp移碼突變導致無功能mRNA，β0中國人3．

核苷酸缺失β密碼子41／42(-4)缺失移碼突變導致無功能mRNA，β0中國人SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity42遺傳方式：不完全顯性遺傳β/β0

β/β0β0/β0SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity43在b珠蛋白基因第2內含子第654位核苷酸C→T突變（IVS-II-654C→T，簡稱b654），是中國人所特有的，而且是最常見的b地貧基因突變之一。654*ABCmRNA(N)mRNA(M)IVSIIVSII579↓73bpIVSIIVSIIb-globingeneb654mRNA的剪接模式SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity44β654基因突變的分子診斷－RT-PCR法診斷剪切異常NormalββPatientββ０

β０

β０254bp181bp輕型重型SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity45β654基因突變的分子診斷－PCR-ASO方法雜交不雜交不雜交雜交正常雜合子輕型重型SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity46反向點雜交同時診斷β基因多個點突變M1M2M3M4M5M6

正常探針突變探針

基因芯片技術現在已經開發了多種診斷β地貧的芯片檢測閱讀系統，系統多采用國際先進的PCR體外擴增結合DNA芯片反向點雜交檢測技術，可快速準確檢測全血樣本中β珠蛋白基因上多個基因位點的突變

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity47二、杜氏肌營養不良癥（DMD）肌營養不良癥由于遺傳方式的不同大致可分為以下幾類：X染色體隱性遺傳的Duchenne型和良性的Becker型常染色體顯性遺傳的面-肩-肱型常染色體隱性遺傳的肢帶型在各型肌營養不良癥中，Duchenne型發病率最高，病情也嚴重，常早年致殘并導致死亡，是遺傳性肌萎縮癥中最有代表性的疾病。

SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity48杜氏肌營養不良是一種X染色體隱性遺傳疾病，主要發生于男孩。據統計，全球平均每3500個新生男嬰中就有一人罹患此病。患者在學齡前就會因骨骼肌不斷退化出現肌肉無力或萎縮，導致不便行走。大概在7歲到12歲時，會徹底喪失行走能力，通常到20多歲就會因為心肌、肺肌無力而死亡。針對該病，醫學界尚無有效療法。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity49（一）遺傳方式和DMD基因突變

遺傳方式：XRDMD基因定位于Xp21.2，是目前已知人類最大的基因，包括79個外顯子基因缺失是DMD發生的主要原因（約占60%~70%）

Xp21.2-p21.1SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity51（二）杜氏肌營養不良癥的分子診斷多重PCR技術診斷DMD基因缺失Chamberlain設計了9對引物，可同時擴增第4、8、12、17、19、44、45、48和51號外顯子Beggs設計了9對引物，可同時擴增啟動子、第3、6、13、43、47、50、52和60號外顯子18對引物的多重PCR擴增可以檢測出DMD基因的98%缺失患者

5’3’PatientsSt(-)(+)12345DMDGENEagfbhcdeabcdefghSchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity54多重PCR診斷DMD基因外顯子缺失I：外顯子45缺失II：外顯子48缺失III：正常對照

多重探針連接擴增Multiplexligation-dependentprobeamplification(MLPA)測序：Sanger雙脫氧鏈末端終止法二代基因測序技術，如雜交測序法（SBH）SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity56血友病為一組遺傳性凝血功能障礙的出血性疾病，其共同的特征是活性凝血活酶生成障礙，凝血時間延長，終身具有輕微創傷后出血傾向，重癥患者沒有明顯外傷也可發生“自發性”出血。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity57三、Ａ型血友病1.血友病A（血友病甲），即因子Ⅷ促凝成分（Ⅷ：C）缺乏癥，也稱AGH缺乏癥，是X染色體隱性遺傳疾病。2.血友病B（血友病乙），即因子Ⅸ缺乏癥，又稱PTC缺乏癥、凝血活酶成分缺乏癥，亦為X染色體隱性遺傳。3.血友病C（血友病丙），即因子Ⅺ（FⅪ）缺乏癥，又稱PTA缺乏癥、凝血活酶前質缺乏癥。為常染色體不完全隱性遺傳。15～20/10萬男孩中有發病，此發病率在所調查的不同的種族和地域之間沒有差異。發病率以血友病A最多占85%，血友病B占15%，血友病C罕見。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity58（一）FⅧ的基因結構

FⅧ基因位于X染色體長臂末端（Xq28），包括26個外顯子和25個內含子，全長186kb。包括26個外顯子和25個內含子，其mRNA全長約為9kb，cDNA為9009bp。其翻譯產物為2351個aa殘基的多肽鏈。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity59（二）Ａ型血友病的遺傳方式和基因突變遺傳方式：XR已報道FⅧ基因點突變174種，缺失117種，插入10種。由于導致HAFⅧ基因的點突變多，故在實際工作中不可能對每一病人作點突變的檢測，所以DNA多態性的連鎖分析仍然是Ａ型血友病基因診斷的常用手段。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity60A型血友病的分子診斷－PCR-RFLP連鎖分析法SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity61血友病A（HemophiliaA,HA）99bp43bp142bpBcl

IBcl

I142bpSchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity63Amp-FLP

在FVⅢ區內尚有兩個VNTP區，一個位于DXS52，另一個位于DX102內，它仍均具有復雜的多態性，亦可用于連鎖分析。SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity64其他診斷方法PCR-SSCPPCR-DGGESchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity65SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity66四、苯丙酮酸尿癥（PKU）（一）苯丙氨酸羥化酶（PAH）基因突變編碼PAH的基因發生突變，致使PAH活性降低或喪失

PAH突變種類達440余種，涉及13個外顯子，突變的80%發生在外顯子5~12編碼區

中國人的PAH基因突變類型30余種，已確定20多種，大約占所有基因突變類型的80%

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