課題2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數專題2微生物的培養與應用一.研究思路㈠.篩選菌株：實驗室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。要分離一種微生物，必須根據該微生物的特點，包括營養、生理、生長條件等，采用選擇培養分離的方法，或抑制使大多數微生物不能生長，或造成有利于該菌生長的環境，經過一定時間培養后使該菌在群落中的數量上升，再通過平板稀釋等方法對它進行純培養分離。一、課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農業氮肥。尿素不能直接被農作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細菌利用尿素的原因土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)脲酶+CO2NH3+H2O4、課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌②統計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌2、實驗室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。什么是選擇性培養基？15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細菌的分離與計數所需培養基：①從物理性質看此培養基屬于哪類？固體培養基㈡.統計菌落數目：1.直接計數法：這種方法是利用特定細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數量。此法的缺點是不能區分死菌和活菌。每毫升原液所含細菌數＝每小格平均細菌數×400×10000×稀釋倍數2.間接計數法(活菌計數法)：⑴原理：在稀釋度足夠高時，微生物在固體培養基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。⑵常用方法：稀釋涂布平板法。⑶注意事項每克樣品中的菌落數＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數。注意事項①為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30——300的平板上進行計數。②為使結果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經涂布，培養計算出菌落平均數。③統計的菌落往往比活菌的實際數目低。這是因為兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統計結果一般用菌落數而不是活菌數來表示。④涂布平板法所選擇倒平板的稀釋度很重要，一般以三個稀釋度中的第二個稀釋度倒平板所出現的平均菌落數在50個左右為最好。除上述兩種常用的計數方法外，還有膜過濾法、比濁法。膜過濾法是當樣品中菌數很低時，可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經處理使膜透明，再在顯微鏡下計算膜上(或一定面積中)的細菌數；比濁法原理是在一定范圍內，菌的懸液中細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借助于分光光度計，在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度表示菌量。實驗測量時一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內，否則不準確。微生物計數法，發展迅速，現有多種多樣的快速、簡易、自動化的儀器和裝置等方法。㈢.設置對照：對照實驗是指除了被測試條件以外，其他條件都相同的實驗，其作用是比照實驗組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試和條件引起相應的結果。設置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。P22旁欄思考題想一想，如何從平板上的菌落數推測出每克樣品中的菌落數？答：統計某一稀釋度下平板上的菌落數，最好能統計3個平板，計算出平板菌落數的平均值，然后按課本旁欄的公式進行計算。

P23討論問題A同學的結果與其他同學不同，可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同，二是由于培養基污染或操作失誤。究竟是哪個原因，可以通過實驗來證明。實驗方案有兩種。一種方案是可以由其他同學用與A同學一樣的土樣進行實驗，如果結果與A同學一致，則證明A無誤；如果結果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養基的配制有問題。另一種方案是將A同學配制的培養基在不加土樣的情況下進行培養，作為空白對照，以證明培養基是否受到污染。通過這個事例可以看出，實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少的。二.實驗的具體操作

㈠.土壤取樣

從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。◆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。㈡.制備培養基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養基。㈢.樣品的稀釋：◆應在火焰旁稱取土壤10g。將稱好的土樣倒入盛有90mL無菌水的錐形瓶中，塞好棉塞。◆在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行。◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保證獲得菌落數在30～300之間、適于計數的平板。細菌稀釋度為104、105、106，放線菌稀釋度為103、104、105，真菌稀釋度為102、103、104。P24旁欄思考題：為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數量，選用的稀釋范圍相同嗎？答：這是因為土壤中各類微生物的數量（單位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數約為2185萬，放線菌數約為477萬，霉菌數約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養的條件。㈣.取樣涂布◆實驗時要對培養皿作好標記。注明培養基類型、培養時間、稀釋度、培養物等。◆如果得到了2個或2個以上菌落數目在30——300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數，如果同一稀釋倍數的三個重復的菌落數相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。㈤.微生物的培養與觀察在菌落計數時，每隔24h統計一次菌落數目。選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，以防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。

◆為了提高效率，在操作時更加有條不紊，應當事先規劃時間。培養不同微生物往往需要不同培養溫度。細菌一般在30～37℃培養1～2d，放線菌一般在25～28℃培養5～7d，霉菌一般在25～28℃的溫度下培養3～4d。思考與討論在微生物培養過程中，為什么每隔24h統計一次菌落數目？菌種鑒定的依據是什么？答：不同種類的微生物，往往需不同的培養溫度和培養時間，每隔24h統計1次菌落數目，選取菌落數目穩定時記錄作為結果，這樣可以防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。不同種類的細菌形成的菌落，在大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作為菌種鑒定的重要依據。三.結果分析與評價1.通過對照實驗，若培養物有雜菌污染，菌落數偏高；若培養物混入其他氮源，則菌落形態多樣，菌落數偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個平板上長有30——300個菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數最合適。同一稀釋倍數的三個重復的菌落數不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。四.課外延伸在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑。培養某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。測定飲水中大腸桿菌數量的方法是將一定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到伊紅美藍培養基上培養，大腸桿菌菌落呈現黑色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數量。

1.使用選擇培養基的目的是（）A.培養細菌B.培養真菌C.使需要的微生物大量繁殖D.表現某微生物的特定性狀，與其他微生物加以區別2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素實踐訓練CD3.下列說法不正確的是（）A.科學家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶B.統計某一稀釋度的5個平板的菌落數依次為M1、M2、M3、