基因工程《基因工程》第一章導論第二章基因工程的酶學基礎第三章基因克隆的載體第四章基因工程的主要技術及其原理第五章目的基因的獲得第六章大腸桿菌基因工程高效表達第二章基因工程的酶學基礎第一節限制性核酸內切酶及其應用第二節DNA連接酶及其應用第三節DNA聚合酶及其應用第四節核酸酶第五節修飾性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.

1、限制性核酸內切酶的發現2、限制性核酸內切酶的分類合命名3、II型限制性核酸內切酶的基本特性4、限制性核酸內切酶的消化反應第一節限制性核酸內切酶及其應用50年代初發現了由寄主控制的限制和修飾現象(B)(K)大腸桿菌B大腸桿菌K114×10—

410—4E.O.P成斑率efficiencyofplatingK限制—修飾的酶學假說(B)(B)B酶切位點不被修飾噬菌體DNA被切割酶切位點被修飾Methylation基因組DNA不被切割1968年，Meselson和Yuan從大腸桿菌K和B中發現了I型限制性核酸內切酶；1970年，Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離純化了第一個II型限制性核酸內切酶HindII，使得DNA分子的體外精確切割成為可能。1、限制性核酸內切酶的發現2、限制性核酸內切酶的分類合命名3、II型限制性核酸內切酶的基本特性4、限制性核酸內切酶的消化反應第一節限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶的概念

限制性核酸內切酶（Restrictionendonucleases）：是一類能夠識別雙鏈DNA分子中某種特定的核苷酸序列，并能精確特異地切割雙鏈DNA分子的核酸內切酶。已經從近300中微生物中分離出了500余種限制性核酸內切酶。限制性核酸內切酶的分類1.限制修飾活性2.內切酶的蛋白質結構3.限制輔助因子4.切割位點5.特異性切割6.基因克隆中I型單一多功能的酶3種不同亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特異性位點1000bp不是無用II型限制酶和修飾酶分開單一成分Mg2+特異性位點及其附近是非常有用III型雙功能酶2種亞基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特異性位點3‘端24-26bp處是有用限制性核酸內切酶的命名屬名種名株名HindIII

HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內切酶1、限制性核酸內切酶的發現2、限制性核酸內切酶的分類合命名3、II型限制性核酸內切酶的基本特性4、限制性核酸內切酶的消化反應第一節限制性核酸內切酶2、識別序列的對稱性識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列大部分酶的切割位點在識別序列內部或兩側識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文結構5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識別序列EcoRI的切割位點II型限制性核酸內切酶的3大特點1、識別位點的特異性

每種酶都有其特定的DNA識別位點，通常是由4、5、6或7個核苷酸組成的特定序列（靶序列）。

回文序列中的單鏈可形成發卡結構雙鏈回文序列可形成十字架結構3、切割位點的規范性

雙鏈DNA被酶切后，分布在兩條鏈上的切割位點旋轉對稱（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。粘性末端

cohesive

ends因酶切位點在兩條DNA單鏈上不同（對稱）酶切后形成的具有互補堿基的單鏈末端結構，酶切產生的兩個粘性末端很

容易通過互補堿基的配對而重新連接起來。平末端

Bluntend因酶切位點在兩條DNA單鏈上相同，酶切后形成的平齊的末端結構，這種末端不易重新連接起來。同裂酶

isoschizomers能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同內切酶。同尾酶

isocaudamers識別的靶序列不同，但能產生相同粘性末端的一類限制性核酸內切酶。注意：由同尾酶產生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識別。與II型核酸內切酶有關的幾個概念幾種II型限制性核酸內切酶的酶切位點PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

EcoRI等產生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHP

經同尾酶消化的DNA末端連接示意圖5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’BamHI5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAGAXXXXXX5’BglII5’XXXXA

GATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAG

AXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’BamHIBglII1、限制性核酸內切酶的發現2、限制性核酸內切酶的分類合命名3、II型限制性核酸內切酶的基本特性4、限制性核酸內切酶的消化反應第一節限制性核酸內切酶

一個酶單位（U）指：在理想的反應條件（適宜的緩沖液和反應溫度，通常為37℃）下，50L反應體系中完全降解1gDNA所需要的酶量。影響酶活性的因素很多，最重要的有：A。DNA的純度和甲基化程度B。甘油的含量（不超過5%）C。反應體系中的離子強度D。反應體系的pH值F。反應的溫度條件（通常為37℃

）酶單位的定義和影響酶活性的因素Buffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L

酶切反應的基本步驟＋－電泳紫外分析37℃1h加反應液CKMBuffer(10X)2.0LWater16.5LDNA1.0LEnzyme0.5LVolume20.0L

1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT第二章基因操作的工具酶第一節限制性核酸內切酶及其應用第二節DNA連接酶及其應用第三節DNA聚合酶及其應用第四節修飾性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.1、DNA連接酶作用的特點2、DNA連接酶的反應條件3、DNA連接的策略第二節DNA連接酶及其應用DNA連接酶的發現

環形DNA分子的發現使科學家相信一定有一種能連接這種Nick的酶存在。

1967年，世界上幾個實驗室幾乎同時發現了一種能夠催化在2條

DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶——DNA連接酶（ligase）。DNA連接酶由大腸桿菌基因組DNA編碼，以NAD+作為能源輔助因子；T4DNA連接酶由大腸桿菌T4噬菌體DNA編碼，以ATP作為能源輔助因子。（1970年）容易制備，而且可以連接完全配對的平末端DNA分子，所以在基因克隆中應用廣泛。NickNickDNA連接酶作用的特點A.連接的兩條鏈必須分別具有3′端自由羥基（-OH）和5′端磷酸基團（-P），而且只有這兩個基團彼此相鄰時才能進行連接反應；B.在羥基和磷酸基團間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程，因此連接反應必須有能量分子的參與，通常有兩種能量分子，即ATP和NAD+。OKNODNA連接酶DNA連接酶的基本性質連接多個平頭雙鏈DNA分子：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA連接酶1、DNA連接酶作用的機理2、DNA連接酶的反應條件3、DNA連接的策略第二節DNA連接酶及其應用DNA連接反應的條件

連接反應最佳溫度為37℃，但是此時粘性末端間氫鍵結合不夠穩定，而且酶活性也會迅速降低。比如，EcoRI粘性末端連接部位只有4個堿基對，很容易斷開。所以通常在4-15℃連接。影響連接效率的因素有：A.溫度（最主要的因素）B.ATP的濃度(10M-1M)C.連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高）D.反應時間（通常連接過夜）E.插入片段和載體片段的摩爾比轉化4℃過夜加反應液CK-重組菌落CK+1、DNA連接酶作用的機理2、DNA連接酶的反應條件3、DNA連接的策略第二節DNA連接酶及其應用粘性末端DNA片段的連接NickNick平末端DNA片段的末端加尾連接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸轉移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA連接酶平末端DNA片段加接頭連接法

銜接物(linker)，也叫接頭，是有人工化學合成的一段10-12個核苷酸的DNA雙鏈，其中包含有1個或幾個限制性酶切位點。使用時只須將銜接物和目的片段的5′端用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后用T4DNA連接酶進行連接，就可獲得能產生粘性末端的DNA片段。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4連接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoRICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA第二章基因操作的工具酶第一節限制性核酸內切酶及其應用第二節DNA連接酶及其應用第三節DNA聚合酶及其應用第四節修飾性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆轉錄酶（反轉錄酶）第三節DNA聚合酶及其應用

大腸桿菌DNA聚合酶I

（E。ColiDNApolI）是KornbergA.1956年首先從大腸桿菌E。Coli細胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括3種不同的酶活力：5′-3′聚合酶活性以雙鏈DNA為模板，催化單核苷酸結合到引物的3′末端，并不斷延伸。5′-3′外切酶活性將雙鏈DNA中游離的5′末端逐個切去。3′-5′外切酶活性將游離的雙鏈或單鏈DNA的3′端降解。不過對于雙鏈的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCCTCCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+CCGATAGCCTGGCTAPolI+Mg2+T

大腸桿菌DNA聚合酶I的三種用途A.制備高比活度的DNA探針

利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。B.用于DNA連接后的大缺口填充

利用5′--3′的聚合酶活性。C.用于DNA的序列分析

利用5′--3′的聚合酶活性。

大腸桿菌聚合酶I的應用示例CCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+缺口轉移(Nicktranslation)CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCCT1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆轉錄酶（反轉錄酶）第三節DNA聚合酶及其應用

Klenow片段的主要用途Klenow片段大腸桿菌聚合酶I全酶經枯草桿菌蛋白酶處理獲得N端三分之二的大肽段，它仍然有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性，但失去了5′→3′的外切酶活性。Klenow片段的主要用途修補限制性酶消化DNA形成的3′隱蔽末端同位素標記DNA片段的末端cDNA克隆中第二鏈cDNA的合成雙脫氧末端終止法測定DNA序列GAACTTAADNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：補平由核酸內切酶產生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標記5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆轉錄酶（反轉錄酶）第三節DNA聚合酶及其應用

T4DNA聚合酶的特點T4DNA聚合酶是

從T4噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來的，它和Klenow片段一樣具有5′→3′的聚合酶活性和3′→5′的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶I的活性高200倍.T4-DNA酶的基本特性：1

5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性2在無dNTP時，可以從任何3‘-OH端外切3在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸暴露時停止4在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導地位

T4DNA聚合酶的用途1、以取代反應標記延伸末端或平頭末端的雙鏈DNA片段2、切平由核酸內切酶產生的3’粘性末端3、

DNA片段的同位素末端標記T4DNA聚合酶活力—取代反應：如果反應體系中僅存在一種dNTP，這時T4DNA聚合酶就會表現出3′→5′外切酶活力，從雙鏈DNA的3′開始降解，直到露出和缺乏的那中dNTP互補的堿基，然后就在此位置發生合成和取代反應。CGTCGCGCAGCGCGTGCAGCGdTTPMg++CGGCAGCGdTTPMg++T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸內切酶產生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5‘…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端標記5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘Mg2+5‘pppdN5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OHHO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolT4-DNApol5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘1、大腸桿菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4DNA聚合酶4、逆轉錄酶（反轉錄酶）第三節DNA聚合酶及其應用

逆轉錄酶—Reversetranscriptase逆轉錄酶是

一種可以有效地將mRNA轉錄成為DNA的酶，其產物稱為cDNA(complementaryDNA).實際上，它也是一種RNA依賴的DNA聚合酶。逆轉錄酶首先是1970年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發現的。這兩個課題組的論文都發在了同一期的《Nature》雜志上。主要用途是

將mRNA轉錄成cDNA以制備基因片段。3’AAAAAAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA

第二章基因操作的工具酶第一節限制性核酸內切酶及其應用第二節DNA連接酶及其應用第三節DNA聚合酶及其應用第四節修飾性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.1、末端轉移酶（terminaltransferase）2、核酸酶SI（SInuclease）4、堿性磷酸化酶第四節修飾性工具酶末端轉移酶的特性末端轉移酶是一類不依賴于DNA模板的DNA聚合酶。末端脫氧核苷酰轉移酶（TdT）來自小牛胸腺該類酶可以在沒有模板鏈存在的情況下，隨機摻入dNTPs，將核苷酸連接到DNA的在3‘羥基，特別是對于平末端的雙鏈DNA末端加尾十分有效。最常見的用途是在酶切產生的平末端加尾以便于創造粘性的互補末端。平末端DNA片段的末端加尾連接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸轉移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA連接酶1、末端轉移酶（terminaltransferase）2、核酸酶SI（SInuclease）3、堿性磷酸化酶（Alkalinephosphatase）第四節修飾性工具酶核酸酶單鏈核酸內切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本反應：內切帶缺口或缺刻的雙鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C

A-C-C-T-C-A…5‘nickgapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘3’AAAAAAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA

發夾結構的切除TTAAAATT單鏈尾巴的切除1、末端轉移酶（terminaltra