復旦大學生命科學DNAsequencing技術的發展 Walter 1975DNAsequencingdeveloped:WalterGilbertandAllanMaxamofHarvardUniversityandFredSangerofCambridgeUniversitysimultaneouslycomeupwithtwotechniquesfordeterminingtheexactsequenceofbasesthatmakeupagene.GilbertandSangersharethe1980NobelPrize(alsowithPaul方末端終止法Sanger-Coulsondideoxyorenzymatic)sequencing化學裂解法Maxam-Gilbertchemical)DNA300～500技術由三部分產生不同長度的 段,差別僅1個堿基在變性的聚丙烯酰胺凝膠上電泳膠的放射性自顯影技術末端終止法 DNA合成的底 ordiphosphate

3’-5’phosphodiesterPhosphodiesterbondsin-O-P-O- O

3’-5’Phosphodiester H

3’-5’phosphodiester-O-P-O- H -O-P-O- O HH HDNADNAHDNApolymeraseIfragmentHHHDideoxySequencingofHReactionRequirementsDideoxySequencingof同位素32P35S基本原

DNA序列其獨特性在 采用聚丙烯酰胺區分長度僅差1個堿基的單鏈DNA一個樣品的4 可以在一個泳道內電泳，從而降 泳道間遷移率差異對精確性的影響過模板反反應后的變性、毛細管電數據分模板DNA用質粒抽提或膠純化試劑盒得到的質粒或PCR產物模 在滅菌水里如ddH2O,超純水；注意不 通過紫外分光光度計測定模板濃度（〉0.1ug/ul質量(OD260/OD280在1.6-1.8之間反 結果一般包括個文件1）.abi件，即測

序列有重復 突 是同語言有關 ,黑猩猩也含有這 .人類因與黑猩猩foxP2順序只有極少差N冬氨酸T氨酸S,絲氨酸;Q,谷胺酰氨酸 引自:Nature418:869-872,一 缺失(genelosses)點突變--類轉換:一種嘌呤轉變為另一種嘌呤,A→G或顛換:一種嘧啶轉變為另一種嘌呤,或相反C→A或A→T核苷酸插入或缺失突堿基代換會產生4種不同義突變:不改變氨基酸順序的堿基代 子發生改變的堿基代無義突變:產生終止 的突變,使翻譯終止,產連讀突變:終止 ,產生延伸的多錯義突變的堿基代換發生 的突變, 位置,將終止 子,使翻譯延續,產生延長的多肽鏈. 子的讀框,但會增加或減少突 基數不成倍數,使后續 缺失(gene （genetranslocationand某一在腫瘤細胞中從的正常位置轉移到其它染色體的某個位置上稱為易位或重排。易位與重排易使癌被激活，或是抑癌失活，從而使細胞。細胞癌的編碼序列在DNA Burkitt淋巴瘤（8q24異位,激活C-myc）。其它類型 突二 突變的檢測方 （allelespecificoligonucleotide,單鏈構象多態性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP） （一）的檢 段，稱RFLP。AlleleIIAllele

Allele Allele

BclIRFLP（血友病等 等 特異性寡核苷酸探針及斑點雜交結探 正常探雜交結突變探突變型遺傳病的直 診 突變體富集（mutant-enriched 存在已知的限制性內切酶位點，用連續二次的巢式PCR來擴增包括存在酶位點編碼子的DNA片段相應的內切酶消化擴增的DN 段，野生型因被酶切而不能進入第二次PCR擴增，而突變型則能完整進入第二次PCR擴增并得到產物的富集。化學（Chemicalcleavageofmismatch,基本原理 化學試劑，故又發展了碳化二亞胺檢測法refractory ARMS法與 法靈敏度比ARMS技 文單鏈構象多態性（single-strandconformational 32P-dNTP摻入PCR↓↓單鏈↓ ↓

2、4、5.該法簡單快速，被廣泛用于未知突變的檢測。由于該法的簡便快速，特別適合大樣本突變研究的 變性高效液相色譜(DenaturingHighPerformanceLiquidChromatographyDHPLC) 技術特點(HighResolutionMelt,原 變化從而雙鏈DNA在升溫過程中先后解開，形成不同融解曲線形狀 條件突變檢測靈敏HRM DNA甲基化檢在哺乳動物細胞中，DNA甲基化主要發生在CpG二核苷胞嘧啶的第五位碳原子上，這樣的胞嘧啶也叫做5胞嘧啶，如圖所，胚胎及維DNA亞硫酸鹽相關方法缺點CGGC將相對而言，Southern方法較復雜存在著酶不完全消化引起的假陽性的問題不適用于混合亞硫鹽甲基化的胞嘧啶則不受影響。這樣DNA包含的甲基化信息就可轉化為序列亞硫酸氫 法（Bisulfitesequencing 處理的序列比較,判斷CpG位點是否 JiangM,etal.Rapid ficationofDNAmethylationbymeasuringrelativepeakheightsindirectbisulfite-pcrsequencingtraces.LabInvest2010;90(2):282-90.甲基化特異性的PCR（Methylation-specific MSPCR是一種快速檢測方法，只需要及少量DNA樣本。MSPCR方法是以引物中所有CpG位點胞嘧啶均甲基片段難擴增，或特異性差等問題，整個CpG島軟件主要作用是輔助設計出具有甲基化(methylation)或硫化(bisulphite)的特殊聚合酶鏈鎖反應的引物(primers)。在進行DNA甲 目前這套專利權仍屬于 結合亞硫酸鹽的限制性內切酶法（combined 甲基化敏感性單鏈構象分析sistrand ysis，MS- 被分離開，隨后行單鏈構象多性分 組整體水平的甲基化檢甲基 分析針對所有的CpG島設計探序列制作 ，甲基 Infinium探針設

原理（探針設計型磁珠、U型磁珠。M型磁珠尾部為U型磁珠尾部為A，用來檢測未甲基化位點。G仍為G，與MMG變為G，與U型磁珠配對，延伸后U型磁珠發光。Infinium針只使用一種磁珠，探針末端為C。配對后只摻入單個堿基（ddNTP-BioT，ddNTP-DNP）。根據熒光類型判斷摻入的堿基類型，第一部 組DNA的提完全可 條件成熟 2：RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在市售RNA酶后進行再處理，配制成10mg/ml。否則可能的是不僅沒有RNA，連DNA也被消化 第二部分亞硫酸氫鈉修 2：加5.5ul新鮮配制的3M342℃水浴4：10mM對苯二酚（氫醌）