瓊脂擴散試驗一、實驗目的學習掌握瓊脂擴散試驗的原理與應用熟悉掌握其基本操作方法二、實驗原理沉淀反應是指可溶性抗原與相應抗體特異性結合，在二者比例適當并有電解質存在及一定的溫度條件下，可形成肉眼可見的沉淀物的反應。免疫擴散法就是使抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中自由擴散而相遇，從而形成抗原抗體復合物，由于此復合物分子量增大并產生聚集，不再繼續擴散而形成肉眼可見的帶狀或線狀沉淀帶。利用瓊脂糖凝膠作為擴散介質是因為一定濃度的瓊脂糖凝膠，其內部為多孔網狀。而且孔徑很大，可以允許大分子物質（分子量自十幾萬到幾百萬以上）自由通過。因為大多數抗原和抗體的分子量都在20萬以上，所以它們在瓊脂糖凝膠中幾乎可以自由擴散。而且瓊脂糖凝膠又具有良好的化學穩定性、含水量大、透明度好、來源方便、處理容易等優點，因此是免疫沉淀檢測技術中最理想的擴散介質。

沉淀線的形狀、位置，與抗原的濃度、擴散速度相關。

瓊脂擴散試驗可在試管內、平皿中以及玻片上的瓊脂中進行。又可分為單向瓊脂擴散試驗和雙向瓊脂擴散試驗兩類。應用（1）抗原或抗體的純度鑒定。也可對抗體效價進行初步估算。（2）用已知抗血清（或抗原）檢測未知抗原（或抗體）（3）抗原或抗體相對分子量的估計雙向瓊脂擴散常見孔型有三孔型、雙孔型、雙排孔型、梅花孔型單向瓊脂擴散試驗

單向瓊脂擴散試驗是一種常用的定量檢測抗原的方法。將適量稀釋后的抗體與等量瓊脂混勻，澆注成板，凝固后，在板上打孔，孔徑3mm，孔間距10mm，孔中加入抗原，每孔10μL，放置濕盒中，37℃溫箱，抗原就會向孔的四周擴散，邊擴散邊與瓊脂中的抗體結合。24h－48h后觀察結果，在兩者比例適當處形成白色沉淀環。沉淀環的直徑與抗原的濃度成正比。如事先用不同濃度的標準抗原制成標準曲線，則從曲線中可求出標本中抗原的含量。本試驗主要用于檢測標本中各種免疫球蛋白和血清中各種補體成分的含量，敏感性很高。

雙向瓊脂擴散試驗測定時將加熱溶化的瓊脂或瓊脂糖澆至玻片上，等瓊脂凝固后，打多個小孔，將抗原和抗體分別加入小孔內，使抗原和抗體在瓊脂板上相互擴散。當二個擴散圈相遇，如抗原和抗體呈特異性的結合且比例適當時，將會形成抗原抗體復合物的沉淀，該沉淀可在瓊脂中呈現一條不透明的白色沉淀線。如果抗原與抗體無關，就不會出現沉淀線，因此可以通過該試驗，用特異性抗體鑒定抗原，或反之用已知抗原鑒定抗體。

另外沉淀線的特征與位置不僅取決于抗原，抗體的特異性和濃度，而且與其分子的大小及擴散速度有關，當抗原體存在多種成分時，將呈現多條沉淀線以至交叉反應線，因此可用來檢查抗原和免疫血清的特異性、純度或濃度比較抗原之間的異同點，因而應用范圍較廣。

圖1雙向免疫瓊脂擴散孔型○○○○

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○○○

○

○○○○○三孔型雙孔型梅花孔型雙排孔型一種抗原抗體系統只出現一條沉淀帶根據沉淀帶出現的數目、位置以及相鄰二條沉淀帶之間的融合、交叉、分枝等情況，就可了解該復合抗原的組成。

免疫擴散

免疫學及免疫學檢驗

A：Ag、Ab濃度及擴散率近似；B：Ag、Ab濃度近似，擴散率Ag＞Ab；C：Ag、Ab濃度近似，擴散率Ag＜Ab；D：擴散率近似，濃度Ag＞Ab；E：濃度Ag＞Ab，擴散率Ag＞Ab；F：濃度Ag＜Ab，擴散率Ag＜Ab沉淀線形狀、位置與抗原抗體擴散率及濃度的關系

免疫學及免疫學檢驗

(1)沉淀線吻合：待檢抗原與標準抗原完全相同。(2)沉淀線相切：待檢抗原中含有與標準抗原相同的抗原，還含有另外的抗原與抗血清相對應。(3)沉淀線相交：待檢抗原有與抗血清對應的抗原，但和標準抗原不同。(4)沉淀線部分吻合：待測抗原和標準抗原性質相同，但含量較低。A1：待檢抗原；A2：標準抗原免疫學及免疫學檢驗抗體效價滴定用梅花型孔，中間放抗原，周圍孔放下不同稀釋度的相應抗體，以出現沉淀線的最高稀釋倍數為該抗體的效價。材料與試劑1．瓊脂粉2．平皿3．打孔器4．生理鹽水或其他緩沖液5.抗原、抗體實驗

操作方法1．稱取一定量的瓊脂粉，按1.5%的比例加入生理鹽水或緩沖液，煮沸融化。2．將融化的瓊脂倒入平皿內，使厚度2mm～3mm。自然冷卻。3．根據要求（孔徑即孔的直徑，孔距即兩孔圓心之間的距離，包括兩孔的半徑3－5mm）打成梅花形孔圖。4．挑出孔內瓊脂，注意不要挑破孔緣。5．在火焰上緩緩加熱，使孔底邊緣的瓊脂少許熔化，以封底，以免加樣后液體從孔底滲漏。6．吸取樣品加入孔內(約15ul)，，以加滿為度。7．加畢后，蓋上平皿蓋，將平皿翻過來，置濕盤中，37℃自由擴散24h～48h。結果判定．用以檢測抗原或比較抗原差異時，將抗血清置中心孔，將待測抗原或需比較的抗原置于周圍相鄰孔。若出現沉淀帶完全融合，證明為同種抗原；若二者有部分相連，表明二者有共同抗原決定簇；若二條沉淀線相互交叉，說明二者抗原完全不同。213456

雙向免疫擴散凝膠染色圖1.雙擴散用于疾病診斷：以IBD診斷為例，中心孔加IBD標準陽性血清，周圍孔分別加IB