細胞培養孫國杰1.1前言（一）細胞培養的主要優點（1）研究對象是活的細胞。（2）研究的條件可以人為地控制。（3）研究的樣本，具有均一性。（4）研究的內容便于觀察、檢測和記錄。（5）研究的范圍比較廣。（6）研究的費用相對經濟。（二）研究的方面（1）細胞內的活動：（2）細胞內部與細胞外界之間的作用：（3）細胞與細胞之間的相互作用：（4）細胞內的流動：（5）遺傳學：（三）應用領域（1）病毒學（2）免疫學（3）遺傳學（4）腫瘤學（5）分化與發育（6）細胞毒試驗（7）臨床醫學及生物技術方面的應用

1.2培養細胞的特征培養細胞的生長方式及類型（一）貼附生長型細胞

（1）成纖維細胞型細胞：（2）上皮型細胞:

（3）游走型細胞（4）多形型細胞（二）懸浮生長型細胞

懸浮生長細胞：血液白細胞、淋巴組織細胞、某些腫瘤細胞、雜交瘤細胞、轉化細胞系等。這類細胞特點：胞體始終是球形、密度較高，培養效率高、易大規模生產。1.2.2細胞增殖的特點貼附

(1)一般認為與電荷有關。

(2)促吸附因子：層連蛋白、纖維連接蛋白、Ⅲ型膠原、血清擴展因子可能參與細胞貼附過程。

(3)A細胞-細胞黏附分子，主要與相應的細胞之間的相互作用有關；B細胞與底物由整合素所介導；C跨膜蛋白多糖，與基質成分如其他蛋白多糖或膠原相互作用運動的接觸抑制及增殖的密度抑制（1）當兩個細胞移動而互相靠近時，其中一個或兩個將停止移動并向另一方向離開，這保證兩個細胞將不會重疊。（2）細胞生長的密度抑制。培養細胞的生長過程

細胞周期間期

1、前期：形成染色體

2、中期:得到完整的染色體群3、后期:4、末期

細胞系的生長過程原代期傳代期衰退期1.原代培養（PrimaryCulture）期：

也稱初代培養，即從體內取出組織接種培養到第一次傳代階段，一般持續1一4周。此期細胞呈活躍的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。初代培養細胞與體內原組織在形態結構和功能活動上相似性大。細胞群是異質的（Heterogeneous），也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強。如把這種細胞群稀釋分散成單細胞，在軟瓊脂培養基中進行培養時，細胞克隆形成率（CloningEfficiency）很低，即細胞獨立生存性差。克隆形成率即細胞群被稀釋分散成單個細胞進行培養時，形成細胞小群（克隆）的百分數。初代培養細胞多呈二倍體核型；由于原代培養細胞和體內細胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象。組織塊培養細胞培養2．傳代期

初代培養細胞一經傳代后便改稱做細胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持續時間最長。在培養條件較好情況下，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系（DiploidCellLine）。為保持二倍體細胞性質，細胞應在初代培養期或傳代后早期凍存。當前世界上常用細胞均在不出十代內凍存。如不凍存，則需反復傳代以維持細胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導致細胞失掉二倍體性質或發生轉化。一般情況下當傳代10～50次左右，細胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細胞進入第三期。初代培養細胞系（連續細胞系）老化傳代期02468101214周16141210863．衰退期：

此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細胞形態輪廓增強，最后衰退凋亡。在細胞生命期階段，少數情況下，在以上三期任何一點（多發生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細胞可能發生自發轉化（SpontaneousTransformation）。轉化的標志之一是細胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系（InfiniteCellLine），也稱連續細胞系（ContinuousCellLine）。無限細胞系的形成主要發生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細胞轉化亦可用人工方法誘發，轉化后的細胞也可能具有惡性性質。細胞永生性和惡性性非同一性狀。二培養法培養瓶培養法培養板培養法

A培養瓶培養法

所謂培養瓶培養法，就是將培養對象直接接種于培養瓶內，再放人培養箱進行培養。

早期的培養瓶是玻璃培養瓶，目前主要用一次性的塑料培養瓶。與一般瓶子不同，采用的材料都是透明、對生物細胞無毒的材料。采用的玻璃大多是硼硅酸玻璃。形狀主要采用適合細胞貼壁生長和顯微鏡觀察的扁平形狀。

與此相關的一種方法是蓋玻片+培養瓶培養，就是以蓋玻片為生長表面，將擬培養的組織、細胞接種于蓋玻片上，然后放進培養瓶中進行培養。這樣具有以下幾優點：。

(1)可以避免培養瓶表面粗糙等原因對培養物的影響。

(2)可以方便地進行顯微鏡觀察、染色等操作，以及永久保存。（3）增加了培養瓶的培養面積。B培養板培養法培養板培養法曾被稱為微量培養法，是現代體外培養技術最為常用的方法之一。具體做法是將培養細胞接種在培養板的孔內，然后在C02培養箱內培養。最常用的培養板有6孔、24孔和96孔培養板，后者最為常用。一般都是一次性使用。原代培養包括：取材、分散細胞、接種、培養等．在所有操作中，多都要注意保持培養物及生長環境的無菌條件。組織塊也可用兩只手術刀片將組織塊切碎，這樣對細胞損傷較小，但操作時間長，容易污染。對某些軟組織如腫瘤、胚眙、腦等可將碎組織塊放人注射器玻璃管中擠壓分離。根據細胞生長的特點，傳代方法有3種：1．懸浮生長細胞傳代離心法傳代：離心（1000轉/分）去上清，沉淀物加新培養液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。傳代培養2．半懸浮生長細胞傳代此類細胞部分呈現貼壁生長現象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。3．貼壁生長細胞傳代貼壁細胞細胞在培養瓶長成致密單層后，繼續生長的空間不足，培養基中的營養成份也消耗較多，同時代謝廢物也有較多堆積，需要分瓶培養，對細胞進行傳代擴增。1.首先將超凈工作臺用紫外

光燈照射滅菌20-30分鐘；

貼壁細胞傳代-消化過程2.關閉超凈工作臺內的紫外光燈,點燃酒精燈(一切操作均需在酒精燈火焰下進行)

3.將消毒過的所用物品放入超

凈工作臺中；

4.將培養好的HeLa細胞培養

皿放入超凈工作臺中；5.用無菌吸管將細胞上原有的

培養液吸凈，棄去培養液。

6.分別取1毫升0.25%胰酶消化液放入培養皿中7.將加有胰酶消化液的培養皿

放入37℃溫箱中消化1分鐘

8.從溫箱中取出培養皿后

用手輕輕拍打培養皿的邊緣；

9.用倒置式顯微鏡觀察細胞

是否完全脫落細胞完全皺縮變圓，此時應棄去胰酶，加入培養基后輕搖可將細胞從細胞瓶壁上洗下，將細胞懸液用吸管吹散后傳代：

有經驗后，可肉眼對光觀察貼壁半透明的細胞層，判斷消化程度。10.待細胞完全脫離后，加入適量的含血清的培養基終止反應如消化過頭，會見到許多細胞脫落隨棄去的胰酶溶液流失。也可以在倒數第二、三步時棄去胰酶，用瓶中殘留的胰酶繼續作用至最后一步的消化程度，這樣略有點過也影響不大。剛加入胰酶，細胞仍呈致密單層：

細胞開始皺縮但不明顯，仍維持細胞正常形態：

細胞基本皺縮變圓，此時細胞吹打可下：

檢查細胞形態及活力：狀態良好的細胞應是輪廓不十分清晰，而生長不良的細胞輪廓反而清晰，細胞間隙增大，有空泡、脂滴、顆粒出現，細胞形態不規則。檢查營養液PH及污染：新鮮的呈桃紅色，PH在7.2-7.4之間。培養一段時間后，PH下降，培養液變黃。ＣＯ２培養箱可自動控制5%ＣＯ２的含量。細胞計數培養的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數。計數結果以每毫升細胞數表示。細胞計數的原理和方法與血細胞計數相同。血細胞計數器：手工計數細胞Coulter計數儀：人工計數程序

用酒精沖洗計數板后擦凈，將蓋片覆在計算板上，微微移向一側，以便滴加細胞懸液.取一吸管伸入培養瓶，輕輕吹打細胞懸液，混勻。從蓋片邊緣滴加細胞懸液，使其充滿計數板和蓋片間的空隙中。注意：勿使液體漫過蓋片或出現氣泡。鏡下觀察計數：計算計數板四角大格內的細胞數，壓線者只計算左側和上方的,右側和下方的不計算在內。

按下式計算：細胞數/毫升原液=

注意：鏡下計數，有時偶爾有兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算。如細胞團占10%以上,說明消化不充分；細胞數少于200個/10平方毫米或多于500個/10平方毫米

時，均說明稀釋不當，需重新置備細胞懸液,再計算。細胞計數：

細胞懸液制備后，要計算所含的細胞數量。一般以細胞數/毫升表示。用品：細胞懸液,培養液,計數板。

1、將血球計數板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數板上。

2、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計算計數板四大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算：

細胞數/ml＝4大格細胞總數/4×10000

注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。

計數法:

尋根問底胰蛋白酶真的不會把細胞消化掉嗎？為什么？提示：胰蛋白酶除了可以消化細胞間的蛋白外，長時間的作用也會消化細胞膜蛋白，對細胞有損傷作用，因此必須控制好胰蛋白酶的消化時間。貼壁生長細胞傳代小結加消化液得到分散的單細胞

倒掉消化液

加培養液終止消化吹打成細胞懸液接種2-4個培養瓶生長貼壁培養的材料與系統貼壁培養的表面要求具有凈陽電荷和高度的表面活性。如果是有機物表面，必須具有親水性，并帶陽電荷。主要材料有：玻璃、塑料、金屬、微載體。貼壁培養的系統主要有轉瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統等。轉瓶培養系統的核心是采用可以搖動或轉動的圓筒培養容器，能使細胞交替接觸培養液和空氣。但是，該系統具有表面積有限、培養條件檢測受到限制、勞動強度大、占用空間大等不足。凡·維茨爾開發的微載體培養系統一定程度上克服了這些缺陷。微載體培養動物細胞是一種適合大規模生產動物細胞生物制品的一種非常有價值的培養技術貼壁生長的細胞生長特性原本為圓形的細胞一經貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進入對數生長期。一般數天后就可鋪滿生長表面，形成致密的細胞單層。這種方法易于觀察細胞生長狀況，適宜于實驗室研究。但是如需繼續培養，需將單層細胞再分散，稀釋后再重新接種，進行傳代培養。貼壁生長的細胞一般生長過程是：

(1)游離期：接種的細胞在培養液中呈懸浮態，由于細胞質的回縮，各種形狀的細胞都開始變圓。

(2)吸附期：細胞類型不同，貼壁時間有所差異。單個細胞、傳代細胞較快，組織塊、較大細胞團較慢。一般多數細胞都可在24h內貼壁，平均貼壁時間大約5-20min。而細胞狀態不好及瀕死細胞、培養基偏酸或偏堿、培養瓶不潔等不利條件都不利于細胞貼壁。

(3)繁殖期：圓形懸浮細胞貼壁后延展成極性細胞，此時雖有細胞運動，卻無細胞分裂。經過一段停滯，開始分裂。隨著細胞數量的增多，細胞間開始接觸并連接成片，這時細胞的運動及分裂都會停止。這種由于細胞間的接觸而發生抑制的現象稱之為接觸性抑制。

(4)退化期：細胞長滿培養瓶壁達到一定密度后，隨著營養物的消耗和代謝物的積累，細胞開始退化。細胞輪廓變強，細胞內有膨脹的線粒體顆粒堆積。如不及時傳代，細胞會從瓶壁上脫下來。貼壁培養優點(1)貼壁培養比較容易更換培養基。(2)容易采用灌注培養，從而達到提高細胞密度的目的。(3)更有效地表達同一產品。(4)可以方便地調節培養液和細胞比例。(5)易于觀察細胞生長狀況。【思考題】多細胞動物和人體的細胞都生活在內環境中，根據你所學的內環境的知識，思考并討