第二章吸光光度法

2.1光譜分析法概述2.2吸光光度法基本原理2.3目視比色法與可見分光光度法2.4顯色反應及顯色條件的選擇2.5吸光度測量條件的選擇2.6分光光度法的應用1學習要求1.了解物質對光的選擇性吸收；2.掌握光的吸收定律；3.掌握比色分析和吸光光度分析方法及其儀器；4.了解顯色劑及顯色反應條件的選擇，光度測定條件的選擇；5.了解吸光光度法的應用。2

2.1光譜分析法概述

一、光分析法及其特點

光分析法：基于電磁輻射能量與待測物質相互作用后所產生的輻射信號與物質組成及結構關系所建立起來的分析方法；電磁輻射范圍：r射線～無線電波所有范圍；相互作用方式：發射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等；光分析法在研究物質組成、結構表征、表面分析等方面具有其他方法不可區代的地位；3三個基本過程：（1）能源提供能量；（2）能量與被測物之間的相互作用；（3）產生信號。基本特點：（1）所有光分析法均包含三個基本過程；（2）選擇性測量，不涉及混合物分離（不同于色譜分析）；（3）涉及大量光學元器件。4二、電磁輻射的基本性質

電磁輻射（電磁波）：以接近光速（真空中為光速）傳播能量；電磁輻射具有波動性和微粒性；

c：光速（3×1010cm/s）

；λ：波長；ν：頻率；σ：波數；E：能量；h：普朗克常數光的波長越短（頻率越高），其能量越大。

c

描述波動性的基本關系式：λ=—(nm)

ν

粒子性，光電效應：光吸收與發射→光量子→粒子性

c

光子能量：E=hν=h—λ

（普朗克方程）↘，E↗；↗，E↘5輻射能的特性：

(1)吸收物質選擇性吸收特定頻率的輻射能，并從低能級躍遷到高能級；

(2)

發射將吸收的能量以光的形式釋放出；

(3)散射丁鐸爾散射和分子散射；

(4)折射折射是光在兩種介質中的傳播速度不同；

(5)反射

(6)干涉干涉現象；

(7)衍射光繞過物體而彎曲地向他后面傳播的現象；

(8)偏振只在一個固定方向有振動的光稱為平面偏振光。678三、光分析法分類

一）.光譜法：

基于物質與輻射能作用時，分子發生能級躍遷而產生的發射、吸收或散射的波長或強度進行分析的方法；光譜法：原子光譜、分子光譜；

91、原子光譜（線性光譜）：基于原子外層電子躍遷的原子吸收光譜（AAS）；原子發射光譜（AES）、原子熒光光譜（AFS）；基于原子內層電子躍遷的X射線熒光光譜（XFS）；基于原子核與射線作用的穆斯堡譜；10

2、分子光譜（帶狀光譜）：

基于分子中電子能級、振-轉能級躍遷；可見光譜法；紫外光譜法（UV）；

紅外光譜法（IR）；

分子熒光光譜法（MFS）；

分子磷光光譜法（MPS）；

核磁共振與順磁共振波譜（N）；

11原子光譜為線狀光譜，分子光譜為帶狀光譜；為什么分子光譜為帶狀光譜？原子光譜圖分子光譜圖12二）、非光譜法：

不涉及能級躍遷，物質與輻射作用時，僅改變傳播方向等物理性質；偏振法、干涉法、旋光法等；13光分析法光譜分析法非光譜分析法折射法圓二色性法X射線衍射法干涉法旋光法原子吸收光譜原子發射光譜原子熒光光譜X射線熒光光譜原子光譜分析法分子光譜分析法紫外光譜法紅外光譜法分子熒光光譜法分子磷光光譜法核磁共振波譜法14四、光分析方法的進展

1.采用新光源，提高靈敏度級聯光源：電感耦合等離子體-輝光放電；激光蒸發-微波等離子體

2.

聯用技術電感耦合高頻等離子體（ICP）—質譜激光質譜：靈敏度達10-20g3.新材料光導纖維傳導，損耗少；抗干擾能力強；15

4.交叉電致發光分析；光導纖維電化學傳感器

5.檢測器的發展電荷耦合陣列檢測器光譜范圍寬、量子效率高、線性范圍寬、多道同時數據采集、三維譜圖，將取代光電倍增管；光二極激光器代替空心陰極燈，使原子吸收可進行多元素同時測定；16

在光譜分析中，依據物質對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法稱為吸光光度法,按所用光的波長不同分為:

紅外吸收光譜：分子振動光譜，吸收光波長范圍2.51000m,主要用于有機化合物結構鑒定。

紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍200400nm（近紫外區），可用于結構鑒定和定量分析。

可見吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍400750nm，主要用于有色物質的定量分析。本章主要講授紫外可見吸光光度法。五、吸光光度法17六、可見吸光光度法特點

比色分析和可見光光度法主要應用于測試樣中微量組分，與滴定分析、重量分析法相比，有如下特點：1、靈敏度高下限一般可達：10-5~10-6mol/L2、準確度高相對誤差：比色法5~6%，光度法2~5%3、操作簡便、測定快速4、應用廣泛

182.2吸光光度法基本原理一、物質對光的選擇性吸收

1．光區（10～1000m）白光(太陽光)：由各種單色光組成的復合光單色光：單波長的光(由具有相同能量的光子組成)光的互補:若兩種不同顏色的單色光按一定的強度比例混合得到白光，那么就稱這兩種單色光為互補色光，這種現象稱為光的互補。互補光：按一定比例混合為白光的兩種光19波長/nm400~430430~480480~500500~560560~590590~620620~760顏色紫色藍色青色綠色黃色橙色紅色可見光區：400-760nm紫外光區：近紫外區200-400nm

遠紫外區10-200nm（真空紫外）202、物質的顏色完全吸收完全透過吸收黃色光光譜示意表觀現象示意復合光Why???

光作用于物質時，物質吸收了可見光，而顯示出特征的顏色。物質呈現的顏色與光有著密切的關系，物質呈現何種顏色，與光的組成和物質本身的結構有關。21

物質的電子結構不同，所能吸收光的波長也不同，這就構成了物質對光的選擇吸收基礎。

物質選擇性地吸收白光中某種顏色的光，物質就會呈現其互補色光的顏色。

溶液顏色的深淺，取決于溶液中吸光物質濃度的高低。

223、光吸收曲線

分子結構的復雜性使其對不同波長光的吸收程度不同；不同波長的單色光照射，吸光度不同—吸收曲線與最大吸收波長

max23吸收曲線的討論：（1）同一種物質對不同波長光的吸光度不同。吸光度最大處對應的波長稱為最大吸收波長λmax（2）不同濃度的同一種物質，其吸收曲線形狀相似λmax不變。而對于不同物質，它們的吸收曲線形狀和λmax則不同24吸收曲線的討論：(3)吸收曲線可以提供物質的結構信息，并作為物質定性分析的依據之一。(4)不同濃度的同一種物質，在某一定波長下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質定量分析的依據。(5)在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據。25二、光的吸收基本定律1.吸光度與透光率透光度(透光率)T

:描述入射光透過溶液的程度:

T=I

t/I0

（T：0~100%）吸光度A＝lg（I0/It)（A：0～∞）吸光度A與透光度T的關系:

A

＝－lg

T全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%26

2.朗伯(Lambert)定律

布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關系。A∝b

3.比耳(Beer)定律

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關系。A∝c

27

A＝lg（I0/It)=εbc

式中A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；

b：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位；

c：溶液的物質的量濃度，單位mol·L－１；

ε：摩爾吸光系數，單位L·mol－１·cm－１；

或:A＝lg（I0/It)=abc

c：溶液的濃度，單位g·L－１

a：吸光系數，單位L·g－１·cm－１

a與ε的關系為：

a=ε/M

（M為摩爾質量）4.朗伯—比耳定律

二者的結合稱為朗伯—比耳定律，數學表達式285.朗伯—比耳定律的物理意義一束平行單色光通過有色溶液，溶液的吸光度與溶液的濃度和厚度成正比，其數學表達式為：

A＝

lg（I0/It)=εbc

朗伯—比耳定律是吸光光度法的理論基礎和定量測定的依據。應用于各種光度法的吸收測量；29

6.吸光系數

摩爾吸光系數ε在數值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度；吸光系數a(L·g-1·cm-1）相當于濃度為1g/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。30（1）吸收物質在一定波長和溶劑條件下的特征常數；（2）不隨濃度c和光程長度b的改變而改變。在溫度和波長等條件一定時，ε僅與吸收物質本身的性質有關，與待測物濃度無關；（3）可作為定性鑒定的參數；（4）同一吸收物質在不同波長下的ε值是不同的。在最大吸收波長λmax處的摩爾吸光系數，常以εmax表示。εmax表明了該吸收物質最大限度的吸光能力，也反映了光度法測定該物質可能達到的最大靈敏度。

摩爾吸光系數ε的討論31（5）εmax越大表明該物質的吸光能力越強，用光度法測定該物質的靈敏度越高。

ε>105：超高靈敏；

ε=(6～10）×104

：高靈敏；

ε<2×104：不靈敏。（6）ε在數值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。32

7.吸光度A的加和性

則總濃度等于各個組分吸光度之和：

A=A1+A2+..........+An

溶液中有幾種吸光物質，彼此間不發生化學反應，則可：33三、標準曲線A

＝－lg

T=εbc

標準曲線：A-C（吸光度-濃度）曲線，又稱校準曲線或工作曲線

01234C/mol·L-1A。。。。*0.80.60.40.20故由曲線的斜率即可求出ε34四.偏離朗伯—比耳定律的原因

標準曲線法測定未知溶液的濃度時，發現：標準曲線常發生彎曲（尤其當溶液濃度較高時），這種現象稱為對朗伯—比耳定律的偏離。引起這種偏離的因素（兩大類）：

（1）物理性因素，即儀器的非理想引起的；

（2）化學性因素。35（1）物理性因素難以獲得真正平行的純單色光。朗—比耳定律的前提條件之一是入射光為平行的單色光。分光光度計只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復合光可導致對朗伯—比耳定律的正或負偏離。

非單色光、雜散光、非平行入射光都會引起對朗伯—比耳定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。

36A克服方法：盡量選用較好的單色器入射波長選擇在峰值位置（在波峰有一個A值相差較小的區域）2.非平行入射光導致光束的平均光程b′大于吸收池厚度b，實際測得的吸光度大于理論值，產生正偏離。37

朗—比耳定律的假定：所有的吸光質點之間不發生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)時才基本符合，當溶液濃度c>10-2mol/L時，吸光質點間可能發生締合等相互作用，直接影響了對光的吸收。

故：朗伯—比耳定律只適用于稀溶液。

(2)化學性因素A散射、假吸收。克服方法：避免溶液產生膠體或渾濁入射光會因散射而損失，導致T減小，實測的A偏高38溶液中存在著離解、聚合、互變異構、配合物的形成等化學平衡時。使吸光質點的濃度發生變化，影響吸光度。例：鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：

2CrO42-＋2H＋=Cr2O72-＋H2O

溶液中CrO42-、Cr2O72-的顏色不同，吸光性質也不相同。故此時溶液pH對測定有重要影響。392.3目視比色法與可見分光光度法

一.目視比色法

1.用同質材料的比色管

2.配制不同量的標準溶液

3.同量的顯色劑，相同的實驗條件，配成一套標準色階

4.待測物與標準色階的配制條件相同，置于色階中比較顏色度40c4c3c2c1c1c2c3c4特點：簡單、可測微量，復合光，誤差大。觀察方向觀察方向41

可見分光光度計二、可見光分光光度法

42一、基本組成光源單色器樣品室檢測器顯示1.光源

在整個紫外光區或可見光譜區可以發射連續光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩定性、較長的使用壽命。

可見光區：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。

紫外區：氫、氘燈。發射185～400nm的連續光譜。43

2.單色器

將光源發射的復合光分解成單色光并可從中選出一任波長單色光的光學系統。①入射狹縫：光源的光由此進入單色器；②準光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。443.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區須采用石英池，可見區一般用玻璃池。4.檢測器

利用光電效應將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.結果顯示記錄系統

檢流計、數字顯示、微機進行儀器自動控制和結果處理45二、分光光度計的類型1.單光束

簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩定性。2.雙光束

自動記錄，快速全波段掃描。可消除光源不穩定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于結構分析。儀器復雜，價格較高。463.雙波長

將不同波長的兩束單色光(λ1、λ2)快速交替通過同一吸收池而后到達檢測器。產生交流信號。無需參比池。△=1～2nm。兩波長同時掃描即可獲得導數光譜。472.4顯色反應及顯色條件的選擇一、顯色反應的選擇1.選擇顯色反應時，應考慮的因素

靈敏度高、選擇性高、生成物穩定、顯色劑在測定波長處無明顯吸收，兩種有色物最大吸收波長之差：“對比度”，要求△>60nm。2.配位顯色反應

當金屬離子與有機顯色劑形成配合物時，通常會發生電荷轉移躍遷，產生很強的紫外—可見吸收光譜。483.氧化還原顯色反應

某些元素的氧化態，如Mn（Ⅶ）、Cr（Ⅵ）在紫外或可見光區能強烈吸收，可利用氧化還原反應對待測離子進行顯色后測定。

例如：鋼中微量錳的測定，Mn2＋不能直接進行光度測定

2Mn2＋＋5S2O82-＋8H2O=2MnO4＋

+10SO42-＋16H+

將Mn2＋

氧化成紫紅色的MnO4＋后，在525nm處進行測定。494.顯色劑無機顯色劑：硫氰酸鹽、鉬酸銨、過氧化氫等幾種。有機顯色劑：種類繁多

偶氮類顯色劑：本身是有色物質，生成配合物后，顏色發生明顯變化；具有性質穩定、顯色反應靈敏度高、選擇性好、對比度大等優點，應用最廣泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。

三苯甲烷類：鉻天青S、二甲酚橙等50二、顯色反應條件的選擇1.顯色劑用量

吸光度A與顯色劑用量CR的關系會出現如圖所示的幾種情況。選擇曲線變化平坦處。2.反應體系的酸度

在相同實驗條件下，分別測定不同pH值條件下顯色溶液的吸光度。選擇曲線中吸光度較大且恒定的平坦區所對應的pH范圍。3.顯色時間與溫度

實驗確定4.溶劑

一般盡量采用水相測定，51三、共存離子干擾的消除1.加入掩蔽劑

選擇掩蔽劑的原則是：掩蔽劑不與待測組分反應；掩蔽劑本身及掩蔽劑與干擾組分的反應產物不干擾待測組分的測定。例：測定Ti4＋，可加入H3PO4掩蔽劑使Fe3+(黃色)成為Fe(PO４)23-(無色)，消除Fe3+的干擾；又如用鉻天菁S光度法測定Al3+時，加入抗壞血酸作掩蔽劑將Fe3+還原為Fe2+，消除Fe3+的干擾。2.選擇適當的顯色反應條件3.分離干擾離子52四、提高光度測定靈敏度和選擇性的途徑1.合成新的高靈敏度有機顯色劑2.采用分離富集和測定相結合3.采用三元(多元)配合物顯色體系

由一個中心金屬離子與兩種(或兩種以上)不同配位體形成的配合物，稱為三元(多元)配合物。多元配合物顯色反應具有很高的靈敏度，一方面是因為多元配合物比其相應的二元配合物分子截面積更大；另一方面是因為第二或第三配位體的引入，可能產生配位體之間、配位體與中心金屬離子間的協同作用，使共軛π電子的流動性和電子躍遷幾率增大。三元配合物主要類型有：三元離子締合物、三元混配配合物、三元膠束(增溶)配合物。532.5吸光度測量條件的選擇

一.入射光波長的選擇

一般應該選擇λmax為入射光波長。如果λmax處有共存組分干擾時，則應考慮選擇靈敏度稍低但能避免干擾的入射光波長。54I0It參比I0′IrI0′

=Ir

+Ia+ItIaI0′IrI0′

–Ir

=Ia+ItI0′

=Ir

+I0

真正進入溶液部分的入射光

二.參比溶液的選擇為什么需要使用參比溶液？

測得的的吸光度真正反映待測溶液吸光強度。55參比溶液的選擇一般遵循以下原則：

⑴若僅待測組分與顯色劑反應產物在測定波長處有吸收，其它所加試劑均無吸收，用純溶劑（水)作參比溶液；⑵若顯色劑或其它所加試劑在測定波長處略有吸收，而試液本身無吸收，用“試劑空白”(不加試樣溶液)作參比溶液；56

⑶若待測試液在測定波長處有吸收，而顯色劑等無吸收，則可用“試樣空白”(不加顯色劑)作參比溶液；

⑷若顯色劑、試液中其它組分在測量波長處有吸收，則可在試液中加入適當掩蔽劑將待測組分掩蔽后再加顯色劑，作為參比溶液。57參比溶液的選擇原則：扣除非待測組分的吸收A（樣）=A（待測吸光物質）+A（干擾＋池）A（參比）=A（干擾+池）M無色+R=MR有色試液不只是M試劑不只是R示意圖參比液無色無色

MR

溶劑空白有色無色M’MR試樣空白無色有色MRR’試劑空白有色有色M’MRR’顯色空白58三.吸光度讀數范圍的選擇濃度測量值的相對誤差（Δc/c）不僅與儀器的透光度誤差ΔT有關，而且與其透光度讀數T的值也有關。

不同的透光度讀數，產生的誤差大小不同：

－lgT=εbc微分：－dlgT＝－0.434dlnT=-0.434T-1

dT

=εbdc兩式相除得：

dc/c=（0.434/TlgT

）dT

以有限值表示可得：

Δc/c=（0.434/TlgT）ΔT

59濃度測量值的相對誤差（Δc/c）不僅與儀器的透光度誤差ΔT有關，而且與其透光度讀數T的值也有關。

是否存在最佳讀數范圍？何值時誤差最小？60最佳讀數范圍與最佳值

設：ΔT=1%，則可繪出溶液濃度相對誤差Δc/c與其透光度T的關系曲線。如圖所示：當：ΔT=1%，T在15%～65%之間時，濃度相對誤差較小，最佳讀