第二章顯微鏡臨床檢驗儀器原理、結構及維修劉甫

醫學檢驗學院免疫學教研室顯微鏡特殊光學顯微鏡電子顯微鏡一、特殊光學顯微鏡用于某些專門的觀察和研究觀察普通顯微鏡看不到或看不清的物體采用特殊的光學技術瑪瑙石化木作者：Thomas

Shearer；城市：美國明尼蘇達州德盧斯；技術：偏振光彩虹小斑馬魚作者：Albert

Pan；單位：美國哈佛大學；技術：熒光蝸牛齒舌作者：David

Walker；城市：英國西約克郡哈德斯菲爾德；技術：偏振光成年老鼠的海馬體作者：Neal

Melvin；城市：美國得克薩斯州達拉斯；技術：熒光星狀硅藻類作者：Petr

Znachor；單位：捷克巴德杰維契水生生物研究所；技術：熒光一、特殊光學顯微鏡特殊光學顯微鏡暗視場顯微鏡熒光顯微鏡倒置顯微鏡偏光顯微鏡相稱顯微鏡紫外光顯微鏡與普通顯微鏡的區別是照明方式可以分辨0.004μm的微粒（普通只能分辨0.2μm，≤0.1μm者稱超顯微粒子）只能看到微粒的數量、位置、輪廓和運動狀態，無法觀察微粒的內部結構暗視場顯微鏡

Dark-fieldmicroscope用強光照射標本，但是不讓強光進入物鏡散射光與暗背景之間形成較強的對比進入物鏡的是強光在標本上形成的"丁達爾效應"而產生的散射光暗視場顯微鏡—基本原理丁達爾效應（Tyndalleffect）：當一束光線透過膠體，從入射光的垂直方向可以觀察到膠體里出現的一條光亮的“通路”，這種現象叫丁達爾現象，也叫丁達爾效應（Tyndalleffect）、丁澤爾現象、丁澤爾效應.

暗視場顯微鏡—基本原理粒子>入射光波長很多倍--光的反射如果粒子小于入射光波長--光的散射

這時觀察到的是光波環繞微粒而向其四周放射的光，稱為散射光或乳光。丁達爾效應就是光的散射現象對于真溶液，雖然分子或離子更小，但因散射光的強度隨散射粒子體積的減小而明顯減弱，因此，真溶液對光的散射作用很微弱。散射光的強度，還隨著微粒濃度增大而增加，因此進行實驗時，膠體濃度不要太稀。由于溶液粒子<1nm，膠體粒子40~90nm<可見光波長（400nm～750nm）產生光的散射現象暗視場顯微鏡—基本原理丁達爾效應暗視場顯微鏡—基本原理采用采用特種聚光鏡--側向照明技術透明物體采用環形光闌擋住中間照明不透明物體采用反射光暗視野照明方式同心圓暗場光闌+環形反射鏡暗視場顯微鏡—照明暗視場顯微鏡—照明熒光顯微鏡，是以紫外線為光源來激發生物標本中的熒光物質，觀察到各種顏色的熒光觀察自發光或受激發光樣品，或用熒光標記物標記樣品，研究熒光物質在組織和細胞內的分布特點：與暗視場形成對比，對比度強可用于觀察活體組織的生理或代謝過程用來分析樣品的化學組分熒光物質標記后觀察熒光顯微鏡

fluorescencemicroscope熒光顯微鏡—種類透射式汞燈光源激發濾色鏡暗場聚光鏡吸收濾色鏡

落射式汞燈光源激發濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡熒光顯微鏡--原理某些物質在一定短波長的光（如紫外光）的照射下吸收光能進入激發態，從激發態回到基態時，能在極短的時間內放射出比照射光波長更長的光（如可見光），這種光就稱為熒光。熒光顯微鏡利用特殊的照明裝置發出激發光，誘發熒光物質發出熒光，通過物鏡作用在樣品上，再由目鏡觀察到肉眼可見的熒光。吸收濾色鏡暗場聚光鏡激發濾色鏡汞燈箱透射熒光顯微鏡構造透射熒光顯微鏡原理落射熒光顯微鏡構造吸收濾色鏡激發濾色鏡分色鏡汞燈紫外線保護罩孔徑光欄（FS）視場光欄（AS）孔徑光闌：決定可以進入光學系統的光束尺寸視場光闌：決定可以觀察和成像的視野范圍落射熒光顯微鏡原理熒光顯微鏡--照明裝置常用高壓水銀燈為光源，光譜峰280~335nm、365~435nm、545~580nm照明方式分透射、落射或組合照明配合專用聚光鏡有明場、暗場、偏光和相襯等照明方式熒光顯微鏡--濾色系統濾色系統由激發濾板和壓制濾板組成。

一、激發濾板根據光源和熒光色素的特點可分為三類激發濾板1、紫外藍光激發濾板：可使300～450nm的光通過。2、紫外藍光激發濾板：可使300～450nm的光通過。3、紫藍光激發濾板：它可使350～490nm的光通過。二、壓制濾板的作用是完全阻擋激發光通過，提供相應波長范圍的熒光。與激發濾板相對應，可分為三類：1、紫外光壓制濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過。2、紫藍光壓制濾板：能通過510nm以上波長的光（綠到紅）。3、紫外紫光壓制濾板：能通過460nm以上波長的光（藍到紅）。熒光顯微鏡--CCD熒光顯微CCD：是與熒光顯微鏡密切相關的數碼攝像產品它可以將熒光顯微鏡拍攝的顯微攝影產品通過usb接口傳輸到電腦中，便于圖像的采集研究通過熒光顯微鏡CCD我們可以拍攝到比單純使用熒光顯微鏡更好的圖片。熒光顯微鏡CCD可以連接熒光顯微鏡組成顯微成像系統。倒置顯微鏡

Invertedmicroscope物鏡與照明系統顛倒配有長工作距離的聚光鏡物鏡放大倍數不超過40倍可使用各種培養皿和培養瓶，特別適用于對活體細胞和組織，流質，沉淀物等進行顯微研究，常裝有攝影（像）裝置。倒置顯微鏡

Invertedmicroscope補充內容光的波粒二象性光到底是什么？……………17世紀明確形成了兩大對立學說牛頓惠更斯微粒說波動說由于波動說沒有數學基礎以及牛頓的威望使得微粒說一直占上風19世紀初證明了波動說的正確性這里的光子完全不同于牛頓所說的“微?！?9世紀末光電效應現象使得愛因斯坦在20世紀初提出了光子說：光具有粒子性

光的微粒說：光是沿直線高速傳播的粒子流。

牛頓支持微粒說。人們都認為牛頓是微粒說的代表。牛頓于1675年曾提出：“光是一群難以想象的細微而迅速運動的大小不同的粒子”，這些粒子被發光體“一個接一個地發射出來”。

易解釋：光的直進性、影的形成、光的反射和折射等現象。

難解釋：（1）一束光入射到兩種介質界面時，既有反射，又有折射。何種情況發生反射，何種情況下又發生折射呢?微粒說在解釋這一點時遇到了很大的困難。（2）兩束光相遇后，為何仍能沿原方向傳播這一常見的現象，微粒說則完全無能為力了。光的波動說：某種振動，以波的形式向四周圍傳播。代表人物：是荷蘭的物理學家惠更斯。易解釋：（1）光的反射、折射、光的反射和折射可以同時發生。（2）兩束光相遇后，為何仍能沿原方向傳播這一常見的現象。難解釋：光的直進性和影的形成。干涉現象：英國醫生兼物理學家托馬斯·楊于1801年進行了著名的楊氏干涉實驗。衍射現象：法國工程師菲涅耳于1818年演示了小孔衍射。干涉和衍射是波動的重要特征，從而光的波動說得到迅速發展。人類對光的本性的認識達到一個新的階段。

電磁說的提出：隨著物理學各方面的發展，麥克斯韋提出了電磁波的理論，進而完善了光是電磁波的結論，惠更斯的波動說發展到了麥克斯韋的電磁說。干涉現象：是波動獨有的特征，只有兩列頻率相同，相位差恒定，振動方向一致的相干光源在空間相遇時相互疊加，才能在某些區域始終加強，在另一些區域則始終削弱，形成穩定的強弱分布的現象--光的干涉。衍射現象：光繞過障礙物偏離直線傳播路徑而進入陰影區里的現象，叫光的衍射。光電效應：19世紀末，光電效應被發現，光的波動說在光電效應面前束手無策，人們又認識到了光確實具有粒子性。愛因斯坦提出了光的量子理論---光子說.人們終于認識到光既具有波動性又具有粒子性。光的波粒二象性光電效應和康普頓效應表明光具有粒子性，光的干涉、衍射、偏振現象表明光具有波動性。光既有粒子性，又有波動性，單獨使用波或粒子的解釋都無法完整描述光的所有性質，人們把這種性質稱為波粒二象性光子是能量為hν的微粒，表現出粒子性，而光子的能量與頻率ν有關，體現了波動性，所以光子是統一了波粒二象性的微粒。但是，在不同條件下的表現不同。大量光子表現出波動性，個別光子表現出粒子性；光在傳播時表現出波動性，而在與其他物質相互作用時表現出粒子性；頻率低的光波動性更強，頻率高的光粒子性更強。綜上所述，光的粒子性和波動性組成一個有機的統一體，并不是獨立存在的。光的粒子性:1.與物質發生作用時,表現出粒子的性質2.少量或個別光子容易顯示出粒子性3.頻率較大時,易顯示粒子性光的波動性:1.傳播時,表現出波的性質2.大量光子容易顯示出波動性3.頻率較小時,易顯示波動性正確理解波粒二象性偏光顯微鏡

polarizingmicroscope利用光的偏振特性對組織內含有的具有雙折射特性的晶體類物質進行觀察需要專門的偏振片（起偏片）將入射光變為偏振光載物臺分為兩層，上層可旋轉，下層設有游標，可分辨0.1o的轉角檢測偏振光需要與上述相同的偏振片（檢偏片）

偏光顯微鏡是利用光的偏振特性，對具有雙折射性(即可以使一束入射光經折射后分成兩束折射光)的晶體、液晶態物質進行觀察和研究的重要光學儀器。利用它可以清楚地觀察到纖維絲、紡錘體、膠原、染色體、卵巢、骨骼、毛發、活細胞的結晶或液晶態的內含物、神經纖維、肌肉纖維、植物纖維等的細微結構，從而可以分析細胞、組織的變化過程。偏光顯微鏡

偏光顯微鏡是在一般顯微鏡的基礎上增添了使普通光轉變成線偏振光和檢測偏振光的裝置或觀察干涉圖樣的特殊透鏡。即光源前有偏振片（起偏器），使進入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器（一個偏振方向與起偏器垂直的起偏器）。偏光顯微鏡偏光顯微鏡

偏光顯微鏡的載物臺是可以旋轉的。當載物臺無樣品時，無論如何旋轉載物臺，由于兩個偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線。而放入旋光性物質后，由于光線通過這類物質時發生偏轉，因此旋轉載物臺便能檢測到這種物體。偏光顯微鏡的結構光通過單軸晶體時的雙折射現象一.雙折射現象：1.雙折射：當一束光在各向異性介質折射時，折射光一般將分為兩束，這種現象稱為晶體的雙折射2.雙折射現象的特點和規律：當一束自然光正入射到冰洲石（或碳等）晶體界面上時，在晶體內部分成兩束折射光，一束總是滿足折射定律稱尋常光（o光），另一束不滿足折射定律，稱為非常光（e光），雙折射后的偏振光都是線偏振光，并且振動方向相互垂直。雙折射現象對于各向異性晶體，一束光射入晶體后，可以觀察到有兩束折射光的現象。n1n2irore(各向異性媒質)自然光尋常光線(o光)-----遵守折射定律非常光線(e光)-----不遵守折射定律o光和e光都是線偏振光。一、自然光一束自然光可以等效為:光振動方向相互垂直的、等振幅的、互不相干的、光強度各占一半的兩束光。自然光的等效由于光源發光是由大量原子發光組成,每個原子發光的電矢量和磁矢量的振動方向都是隨機的,

和

在各方向的振動都存在;感光作用決定于電矢量

(光矢量),且的振幅可看作完全相等.自然光的圖示法：自然光自然光的等效二、線偏振光(完全偏振光)只在某一方向有光振動的光，稱為線偏振光。E播傳方向振動面·面對光的傳播方向看線偏振光可沿兩個相互垂直的方向分解EEyEx

yx線偏振光的表示法：光振動垂直畫面光振動平行畫面

某些物質能強烈地吸收某個方向的光振動，當自然光照射其上時，只允許某個特定方向的光振動通過，形成偏振光。起偏和檢偏一、起偏從自然光獲得偏振光的過程，稱為起偏。起偏器:產生偏振光的光學器件.偏振片:只能透過某一方向光振動的光學器件.二、檢偏用偏振片分析檢驗光的偏振態過程.I?P待檢光旋轉法.9......起偏器檢偏器自然光線偏振光偏振光通過旋轉的檢偏器，光強發生變化.....起偏器檢偏器自然光線偏振光偏振光通過旋轉的檢偏器，光強發生變化.....起偏器檢偏器自然光線偏振光偏振光通過旋轉的檢偏器，光強發生變化.....起偏器檢偏器自然光線偏振光兩偏振片的偏振化方向相互垂直光強為零偏振光通過旋轉的檢偏器，光強發生變化.....起偏器檢偏器自然光線偏振光偏振光通過旋轉的檢偏器，光強發生變化.....起偏器檢偏器自然光線偏振光偏振光通過旋轉的檢偏器，光強發生變化.....檢偏器自然光通過旋轉的檢偏器，光強不變自然光.....檢偏器自然光自然光通過旋轉的檢偏器，光強不變.....檢偏器自然光自然光通過旋轉的檢偏器，光強不變.....檢偏器自然光自然光通過旋轉的檢偏器，光強不變.....檢偏器自然光自然光通過旋轉的檢偏器，光強不變.....檢偏器自然光自然光通過旋轉的檢偏器，光強不變.....檢偏器自然光自然光通過旋轉的檢偏器，光強不變相襯顯微鏡

光線只有通過染色標本時其波長、振幅發生變化，人眼才能看見?；罴毎臀慈旧臉吮居捎诠獾牟ㄩL和振幅不發生變化，人眼看不到，但其相位有變化，因此利用光的干涉和衍射效應把透過標本不同區域的光波光程差轉變成振幅差，使細胞內各種結構之間呈現清晰可見的明暗對比。

相襯顯微鏡比普通光學顯微鏡多了2個部件：在聚光器上增加一個環形光闌；在物鏡后焦面增加一個相板，相板上有一個環形區，通過環形區的光比從其它區域透過的光超前或滯后1/4λ，這樣就使通過標本不同區域光波的相位差轉變為振幅差。相襯顯微鏡相襯顯微鏡照明原理

光通過標本致密區時發生衍射，產生偏折光，相位和未受影響的直射光相比被推遲了1/4λ。只有未發生偏折的的直射光可通過相位板的環形區，其它的偏折光在物鏡的后焦面上產生了一個與通過相位板的環形區的光不同的1/4λ的光程差。兩組光在平面上成像。相襯顯微鏡

如果相板的環形區使直射光超前1/4λ，加上開始直射光超前的1/4λ，直射光共超前1/2λ，直射光和偏折光疊加形成的合成波振幅減少，產生暗反差。如果相板的環形區使直射光滯后1/4λ，加上開始直射光超前的1/4λ，兩者相抵直射光不發生變化，直射光和偏折光無相位變化，形成的合成波振幅增加，產生明反差。相襯顯微鏡紫外光顯微鏡

紫外光源可以明顯提高顯微鏡的分辨率，對于生物樣品使用紫外光照明還具有獨特的效果。細胞中的原生質對可見光幾乎是不吸收的，而蛋白質和核酸等生物大分子對紫外光具有特殊的吸收作用。因此，可以使用紫外光顯微鏡（ultravioletmicroscope）研究單個細胞的組成與變化情況。二、電子顯微鏡一、電子顯微鏡的基本結構二、電子顯微鏡的分類及其應用

光鏡分辯極限為0.2m，小于0.2m的微細結構的光波可產生衍射現象,這種光波經過物體時可繞過物體就象無物體經過一樣,因此無法用光鏡觀察。這就需要一種更大分辮力的儀器來觀察比0.2m更小的物體的微細結構。

一、電子顯微鏡的基本結構電子光學系統真空系統供電系統機械系統觀察顯示系統照明系統成像系統（一）電子光學系統---照明系統電子光學系統主要由電子槍和聚光鏡組成。電子槍是發射電子的照明光源。聚光鏡是把電子槍發射出來的電子會聚而成的交叉點進一步會聚后照射到樣品上。照明系統的作用就是提供一束亮度高、照明孔徑角小、平行度好、束流穩定的照明源。

1.電子槍

電子槍是電鏡的電子發射源，其作用是形成電子束，并控制電子束的發射，獲得一高亮度和高穩定度的照明電子光源。常用的電子槍是熱陰極三極電子槍，它由發夾形鎢絲陰極、柵極和陽極組成。電子槍的結構及工作原理圖燈絲2.聚光鏡

聚光鏡用來會聚電子槍射出的電子束，以最小的損失照明樣品，調節照明強度、孔徑角和束斑大小。一般都采用雙聚光鏡系統。第一聚光鏡是強激磁透鏡而第二聚光鏡是弱激磁透鏡。（一）電子光學系統——成像系統

電子透鏡：能使電子束聚焦的裝置電子透鏡是電鏡的核心部件，其工作方式是利用復雜的電極和線圈結構形成靜電場和磁場。電子透鏡存在各種像差（aberration），這是影響成像質量的主要因素。電子透鏡(二)真空系統

主要由機械泵、油擴散泵或離子泵、聯動控制閥門、真空排氣管道、空氣過濾器和用于真空度指示的真空測量規等組成。(三)供電系統

供電系統包括