醫學畢業論文答辯研究生：XXX導師：XX教授MEDICALTHESISDEFENSE2021/4/261精品研究的背景及意義材料與方法實驗結果與討論123目錄CONTENTS總結不足與展望致謝4562021/4/262精品

第一部分研究的背景及意義PART01012021/4/263精品研究的背景及意義對缺血性腦中風發病機制及防治的研究已成為醫學界關注的重點。缺血大腦迅速獲得血液供應是阻止缺血性神經元損傷的首要措施，然而，大量的血液迅速再灌注又進一步加重缺血組織的損傷--即缺血再灌注損傷。氧化應激和炎癥是缺血再灌注損傷病理生理機制的重要組成部分。腦缺血再灌注早期即有大量活性氧產生，并迅速啟動損傷級聯，加劇了初始損害最終導致神經元不可逆的損傷。因此，再灌注早期阻斷氧化應激損傷是有效降低遲發性神經元死亡的關鍵。2021/4/264精品研究的背景及意義Genistein具有酪氨酸激酶抑制劑活性和抗氧化作用。4Genistein作為酪氨酸激酶抑制劑可有效減弱短暫全腦缺血造成的神經元的延遲性死亡；一個單純的氧誘導的腦缺血小鼠模型顯示Genistein具有抗氧化活性。5eNOS活性的升高對腦中風具有有益作用。另研究發現，Genistein能夠誘導eNOS活性并激活核因子NF-E2相關因子(Nrf2)，進而誘導抗氧化酶表達、減少心血管疾病的發生。62021/4/265精品

那么，Genisteinpostconditioning(GPC，即缺血后給予Genistein)是否能通過eNOS/Nrf2/ARE信號通路降低氧化應激，從而發揮抗缺血性神經元損傷的作用？目前尚未見報道。

本研究采用四動脈結扎(4-VO)全腦缺血模型，觀察GPC對缺血性神經元的保護作用，并探討其可能的分子機制，為臨床防治缺血性腦中風提供理論依據。研究的背景及意義2021/4/266精品

第二部分材料與方法PART02022021/4/267精品大鼠腦立體定位儀大鼠腦微量注射泵冰凍切片機激光掃描共聚焦顯微鏡酶標儀電泳設備搖床Morris水迷宮超低溫冰箱等組織裂解液BCA蛋白濃度測定試劑盒eNOS、p-eNOS、Nrf2、HO-1一抗及其相應的二抗NBT/BCIP顯色液NeuN、4-HNE、8-OHdG一抗及對應的熒光二抗TUNEL試劑盒材料與方法2021/4/268精品SPF級成年雄性SD大鼠隨機分組及4-VO模型ShamI/RVeh1(IR+DMSO)GPCVeh2(GPC+NaCl)L-NAME30m24hI10mI10mI10mI10mI10m30m6h1d5d椎動脈電凝并分離頸總動脈缺血尾靜脈注射Genistein1mg/kg側腦室注射L-NAME1mg/5μl0.9%NaCl0.1%DMSO3d7d9d材料與方法2021/4/269精品再灌注5d檢測海馬CA1區神經元的凋亡及存活實驗方法及檢測指標再灌注30min,6h,1d,3d觀察p-eNOS,Nrf2,HO-1蛋白表達免疫熒光染色法蛋白免疫印跡技術TUNEL染色及NeuN染色再灌注3d觀察海馬CA1區神經元8-OHdG,4-HNE,Nrf2,HO-1蛋白的表達及定位Morris水迷宮再灌注7-9d，檢測大鼠的空間學習和記憶能力材料與方法2021/4/2610精品9、人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:53:47PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個人炫耀什么，說明他內心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/3

數據整理后，應用SigmaStat3.5統計軟件進行統計學分析。所有計量資料數值以均數±標準差表示，采用單因素方差分析(ANOVA)，多個實驗組與一個對照組比較用最小顯著差法(LSD)，各實驗組之間比較采用q檢驗(Newman-keulstest)，P<0.05為差異有統計學意義。材料與方法2021/4/2612精品

第三部分實驗結果與討論PART03032021/4/2613精品圖1、NeuN及TUNEL免疫熒光染色觀察再灌注5d大鼠海馬CA1區神經元的存活及凋亡ABC實驗結果與討論圖A：NeuN(紅色)染色：生存的神經元；TUNEL(綠色)染色：凋亡樣神經元；圖B：海馬CA1區1mm

長度內NeuN陽性神經元數量統計圖；圖C：海馬CA1區1mm長度內

TUNEL陽性神經元數量統計圖;*P<0.05vs.I/R組，#P<0.05vs.GPC組，n=5;40×,bar=50μm2021/4/2614精品小結1Genistein后處理對缺血性神經元損傷具有保護作用，eNOS激酶抑制劑L-NAME減弱了該作用，說明eNOS可能參與了此保護作用。Genistein后處理是否誘導eNOS激活（磷酸化）?實驗結果與討論2021/4/2615精品圖2GPC對大鼠海馬CA1區神經元eNOS、p-eNOS蛋白表達的影響圖A：再灌注不同時間點p-eNOS、eNOS蛋白的表達；Sh：Sham組；R：再灌注；－：I/R組；＋：

GPC組；GPC:Genistein后處理；圖B：p-eNOS蛋白表達統計圖：n=4；*p<0.05vs.I/R組AB實驗結果與討論2021/4/2616精品AB實驗結果與討論圖3L-NAME對再灌注3d大鼠海馬CA1區神經元eNOS磷酸化水平的影響圖A：各實驗組再灌注3dp-eNOS蛋白表達；圖B：各實驗組再灌注3dp-eNOS蛋白表達統計圖，n=5，*p<0.05VS.I/R組；#p<0.05VS.Vehicle2組2021/4/2617精品小結2Genistein后處理可誘導全腦缺血大鼠海馬CA1區eNOS磷酸化水平升高，eNOS激酶抑制劑L-NAME可有效降低GPC誘導的eNOS磷酸化水平。結果揭示：eNOS磷酸化水平升高參與了Genistein的神經保護作用。Genistein后處理是否能有效降低缺血再灌注后神經元的氧化應激損傷呢?4-HNE是脂質過氧化的最終產物，被公認為氧化應激最穩定的標記物8-OHdG，是DNA氧化損傷的特異產物實驗結果與討論2021/4/2618精品圖4全腦缺血再灌注3d，各實驗組大鼠海馬CA1區4-HNE及8-OHdG免疫熒光染色GPCI/RABGPCI/R圖A：綠色:NeuN；紅色:4-HNE；圖B：紅色:DAPI；綠色:8-OHdG；n=4-5；40×；bar=50μm實驗結果與討論2021/4/2619精品小結3

GPC能有效降低氧化應激損傷；eNOS激酶抑制劑L-NAME廢除了此神經保護作用。Nrf2/ARE信號是生物體內抗氧化應激反應最重要的內源性防御系統。那么，GPC是否通過eNOS誘導了此信號通路?實驗結果與討論2021/4/2620精品C圖5A-CGPC促進大鼠海馬CA1區Nrf2蛋白表達圖A：再灌注不同時間點核內Nrf2蛋白表達；圖B：再灌注不同時間點核內Nrf2蛋白表達統計圖，n=4，*p<0.05vs.I/R組；圖C：再灌注3d各實驗組Nrf2蛋白的表達及統計圖；*p<0.001vs.I/R組，#p<0.001vs.Vehicle2組A實驗結果與討論2021/4/2621精品圖5D免疫熒光染色法觀察大鼠再灌注3d海馬CA1區神經元內Nrf2的表達及定位綠色：Nrf2；紅色:NeuN；黃色：二者的共定位；40×；bar=30μm.L-NAME實驗結果與討論2021/4/2622精品圖6大鼠再灌注3d海馬CA1區神經元內HO-1蛋白表達及其與Nrf2的共定位圖A-B：HO-1蛋白表達及其統計圖；圖C：HO-1與Nrf2蛋白的共定位，*p<0.05VS.I/R組；#p<0.05VS.vehicle2組；綠色：Nrf2；紅色：HO-1；藍色：DAPI；合成圖為三者的共定位；40×；n=4-5；bar=50μm；CL-NAMEI/RShamGPCVehicle2L-NAMEHO-1NeuNA實驗結果與討論2021/4/2623精品小結4實驗結果與討論海馬是學習和記憶的重要部位，而海馬CA1區是缺血最敏感的區域。那么，GPC是否能改善大鼠缺血后空間學習記憶能力?GPC可顯著增加海馬CA1區神經元胞核中Nrf2蛋白的表達并引起下游靶基因HO-1的表達，而L-NAME阻斷了此作用。此結果進一步揭示GPC通過eNOS誘導了Nrf2/HO-1抗氧化信號通路，從而阻斷了缺血再灌注后遲發性神經元損傷。2021/4/2624精品圖7GPC對大鼠缺血后空間學習和記憶能力的影響圖A-B：潛伏實驗和探索實驗統計圖；n=5；*p<0.05vs.I/R組；#p<0.05vs.GPC組.圖C-D：潛伏實驗和探索實驗大鼠游泳路程軌跡圖DC實驗結果與討論2021/4/2625精品小結5GPC能有效的改善大鼠缺血后的空間學習和記憶能力。實驗結果與討論2021/4/2626精品

第四部分總結PART04042021/4/2627精品GPC對缺血性神經元損傷具有保護作用。GPC能有效改善大鼠短暫全腦缺血后的認知功能。GPC可通過誘導eNOS磷酸化水平并上調Nrf2/HO-1信號通路，從而降低腦缺血誘導的氧化應激損傷。020301總結2021/4/2628精品

第五部分不足與展望PART05052021/4/2629精品不足與展望GPC是否可增加Nrf2的DNA結合活性有待進一步研究。GPC是否也觸發了其它促生存信號轉導通路（如雌激素受體信號），從而起到抗缺血性神經元損傷的作用。其確切的機制還有待多層面、多角度的進一步探究。2021/4/2630精品

第四部分致謝PART04042021/4/2631精品

實驗和論文的最終完成是我的導師**教授精心指導的結果。謹借此機會，向我敬愛的恩師表示最衷心的感謝！感謝河北聯合大學研究生學院、基礎醫學院病理教研室以及形態中心的各位老師所給予我的指導、關心與包容！感謝在學習及生活中曾經與我朝夕相處、共同努力、不懈追求的同學和朋友們！感謝我的父母、親人和工作單位對我的支持與鼓勵，正是他們的理解和關懷使我順利的完成學業！致謝2021/4/2632精品醫學畢業論文答辯研究生：XXX導師：XX教授Genistein后處理介導大鼠海馬CA1區eNOS/Nrf2/HO-1信號通路及其