項目九高效液相色譜法一.高效液相色譜法（HPLC）概念？

指以液體為流動相的色譜技術法高壓泵化學鍵合固定相高靈敏用檢測器二.高效液相色譜法的特點？1、分離效能高2、選擇性高3、分析速度快4、檢測靈敏度高三、HPLC與GC的區別？三、HPLC與GC的區別1．分析對象的不同2．流動相的區別3．操作條件的差別流程及主要部件

HPLC主要有高壓輸液系統、進樣系統、分離系統、檢測系統和記錄儀組成儀器分析一高壓輸液系統1.貯液器溶劑使用前必須過濾脫氣2.高壓輸液泵泵有恒流泵和恒壓泵兩類往復式柱塞泵（恒流泵）電動機偏心輪柱塞柱球形單向閥溶劑3.梯度洗提裝置梯度洗脫：分離過程中，通過改變流動相組成來增加洗脫能力的一種方法通過梯度裝置可得兩種或三種、四種溶劑按一定比例混合進行二元三元或四元梯度洗脫高壓梯度（內梯度）：將溶劑用高壓泵增壓后輸入色譜系統的梯度混合室，加以混合后送入色譜柱。低壓梯度（外梯度）：在常壓下預先按一定程序將溶劑混合后再用泵輸入色譜柱ABABCC儀器分析二進樣系統1.注射器進樣

1—10μL微量注射器，類似于氣相色譜進樣針，只是其針頭為平頭。儀器分析3.高壓定量進樣閥（六通閥）

儀器分析三分離系統

色譜柱為直型不銹鋼柱，內徑4.6或2mm，柱長15～30cm。四檢測系統專用型：紫外吸收檢測器（UVD紫外吸收檢測器五記錄系統色譜工作站第三節高效液相色譜法的分類及分離原理按固定相分類按分離機理分類液液色譜法LLC液固色譜法LSC分配色譜法吸附色譜法離子交換色譜法分子排阻色譜法化學鍵合色譜法親合色譜法膠束色譜法HPLC一液液分配色譜法

固定相與流動相均為液體（互不相溶）

基本原理：試樣溶于流動相后，在色譜柱內經過兩相分界面進入固定液中。由于試樣組分在固定相和流動相中的溶解度存在差異，因而組分在兩者間進行分配液一液分配色譜法與氣一液色譜法的比較

相似處：分離順序決定于分配系數的大小，K大的組分保留值大

不同處:

GC流動相性質對K影響不大，而LC中流動相種類對K影響較大正相色譜——固定液極性>流動相極性

極性小的組分先出柱，極性大的組分后出峰;

適于分離極性組分

反相色譜——固定液極性<流動相極性

極性大的組分先出柱，極性小的組分后出峰;

適于分離非極性組分固定相：早期涂漬固定液，系統內部壓力大，固定液易流失，不實用，故較少采用；

化學鍵合固定相：利用化學反應將固定液的官能團鍵合在載體表面。C-18柱（反相柱）化學鍵合固定相：將具有官能團的固定相鍵合到載體表面，構成化學鍵合相化學鍵合色譜法：以化學鍵合相為固定相的色譜法，簡稱鍵合色譜法硅膠表面十八烷基硅烷鍵合相ODS化學鍵合固定相特點

不易流失

熱穩定性好

化學性能好

載樣量大

適于梯度洗脫應用適用于極性較小的樣品分離。可以分離同系物、復雜稠環芳烴以及藥物、激素、天然產物、農藥殘留量的測定在高效液相色譜法作為分離方法中，有80%的物質的分離依靠反相色譜來完成。在反相色譜中，C18是常用的填充載體，水是常用的流動相弱組分，重要的是選擇流動相的強組分，常用的強組分有甲醇、乙腈與四氫呋喃稠環芳烴的分析

稠環芳烴多為致癌物質固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC

柱壓：70104Pa

檢測器：紫外檢測器應用舉例二液固吸附色譜分離原理以固體吸附劑為固定相的液相色譜法。利用各組分在固定相上吸附能力的不同將它們分離吸附脫附再吸附再脫附

…分離過程是一個吸附－脫附的平衡過程液固吸附色譜法分離機理固定相

極性固定相：硅膠、氧化鎂、氧化鋁等

非極性固定相：活性炭、聚合物小球等

較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑流動相各種不同極性的一元或多元溶劑,常用的有甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等出柱順序強極性組分后出柱，弱極性組分先出柱應用中等分子量的油溶性樣品如油品、脂肪、芳烴等不同極性取代基的化合物結構異構體和幾何異構體混合物的分離環境中有機氯農藥殘留量分析固定相：薄殼型硅膠(37～50m)

流動相：正己烷流速：1.5mL/min

色譜柱：50cm2.5mm(內徑)

檢測器：差示折光檢測器

可對水果、蔬菜中的農藥殘留量進行分析三凝膠色譜（尺寸排阻色譜）固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)分離原理：按分子尺寸大小差異進行分離當被測組分隨流動相通過凝膠色譜柱時:①

尺寸大于孔徑的組分分子不能滲入凝膠孔隙而被全部排斥，最先流出色譜柱②尺寸小于孔徑的分子則全部滲入凝膠孔隙，最后流出③尺寸中等分子部分滲入較大孔隙，而排斥較小孔隙。因此介于中間流出分離原理示意圖排阻色譜分離示意圖相對分子質量差別大于10％的化合物才可以分離相對分子質量V0ViA排斥B全滲透選擇滲透V0ViVt洗脫體積固定相三種:軟質凝膠半硬質凝膠硬質凝膠流動相：僅作為載體，不與試樣本身或填料有任何相互作用；且完全溶解試樣、在分離溫度下黏度低度，其沸點通常比柱溫高20~50℃，與檢測器匹配等應用

主要用于高分子化合物的分子量及分子量分布測定和高分子雜質測定

2005-10版藥典大量收載該法1.聚乙二醇400002.聚乙二醇100003.聚乙二醇30004.聚乙二醇10005.聚乙二醇四、離子交換色譜(IEC)基本原理：根據不同組分離子對固定離子基團的親和力的差別而達到分離目的。組分在固定相上發生的反復離子交換反應；親和力大，保留時間長固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-應用主要用來分離離子或可離解的化合物，不僅應用于無機離子的分離如稀土化合物。還用于有機物分離（分離氨基酸、核酸、蛋白質等）離子交換色譜法油田水質中的陰離子分析固定相：薄殼型陰離子交換樹脂(3×250mm)流動相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1

Na2CO3第四節高效液相色譜

法的應用(P244)第五節高效液相色譜分離方法的選擇一、選擇合適的液相色譜分離類型

了解分析對象要分析的組分的大致濃度干擾物質試樣的性質結構分子量酸堿性溶解性二、選擇合適的分析條件色譜柱流動相檢測器的種類及條件（波長等）