實驗二十一細菌的芽孢和莢膜染色法

一、實驗目的：

1、繼續學習微生物涂片的制作方法；2、掌握芽孢、莢膜染色的基本原理及方法。

二、實驗原理：

芽孢、莢膜染色法都是利用細菌

各部位（分）的構造不同，它們對染料的親和力也不同。因此，可以采用各種特殊染色方法，使細菌細胞的不同構造能在顯微鏡下顯示出來，便于觀察和區別。

三、實驗材料：

1、菌種：枯草桿菌、鉀細菌；2、染色液：孔雀綠、蕃紅溶液、碳素墨水、甲醇、生理鹽水等；3、器材：試管夾、酒精燈、接種針、載玻片、顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙等。

四、方法及步驟：

1、芽孢染色法：某些細菌（革蘭氏染色陽性桿菌）生長到一定時間（對數期后期），在細胞內形成一個圓形、橢圓形或圓柱形的結構，這種結構稱為芽孢，由于在細胞內也叫內生孢子。

芽孢的特點是不能繁殖，休眠體，含水少、含脂高、不透明，對外界環境有很強的抵抗能力，有的芽孢在一定條件下可保持活力數年甚至數十年之久，芽孢尤其能耐高溫，像枯草桿菌的芽孢，在沸水中可存活1小時，破傷風芽孢桿菌可存活3小時，而肉毒梭狀芽孢桿菌的芽孢可忍受6小時，即使在180℃干燥箱中仍可存活10分鐘，這主要是2.6-吡啶二羧酸與鈣的復合物占芽孢干重5-15%的原理。芽孢有的長在中央或近中央，圓形或橢圓形，芽孢的大小，位置，在分類鑒定上有一定的意義，它僅僅是芽孢細菌生活史的一個環節，它還是檢驗培養基滅菌徹底不徹底的依據。芽孢染色的原理是利用細菌的芽孢和菌體對染料的親和力不同的原理，用不同的染料進行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區別。細菌的芽孢壁比營養細胞的細胞壁厚，致密、透性低，著色和脫色都比營養細胞困難。因此，一般采用一種堿性染料（孔雀綠）并在微火上加熱或延長染色時間。我們采用加熱的方法，使菌體和芽孢同時都染上色后，再用水沖洗脫去菌體的染料，此時仍保留芽孢的顏色，并用對照染料來染菌體，這樣就將芽孢和菌體分別染成兩種不同的顏色。其步驟如下：⑴取枯草桿菌制成涂片、干燥、固定；⑵用試管夾夾住玻片的一端，在涂片上滴加孔雀綠3-4滴；⑶加熱5分鐘使冒蒸汽，切勿煮干；⑷冷卻、水洗（細水）；⑸蕃紅溶液復染2-3分鐘，水洗；⑹干燥、鏡檢；⑺結果：芽孢呈綠色，菌體呈紅色。芽孢的孔雀綠染色2、莢膜染色法：有些細菌生活在一定營養條件下，可向細胞壁表面分泌一層松散透明、疏松、柔軟、粘度極大，粘液狀或膠質狀的物質即為莢膜。莢膜的化學成分，主要是多糖、多肽、蛋白質、脂以及由它們組成的復合物-脂多糖、脂蛋白等。莢膜雖不是細胞的主要結構，但它是細胞外碳源和能源性貯藏物質，并能保護細胞免受干燥的影響，同時能增加默某些病原菌的致病能力，使之抵御宿主吞噬細胞的吞噬。產莢膜細菌，常常給生產帶來麻煩，食品工業中的粘性面包，粘性牛奶，都是由于染了此類細菌引起的，對制糖工業威脅更大，由于產莢膜細菌的大量繁殖，增加了糖液粘度，影響了過濾速度，使生產蒙受損失。但在一定條件下，有害的東西可變為有益的物質，如腸膜明串珠菌，在人為控制下，讓其利用蔗糖合成大量產莢膜物質—葡聚糖。葡聚糖是生產右旋糖酐的原料，而右旋糖酐是帶代血漿的主要成分，具有維持血液滲透壓和增加血溶量的作用，臨床上還用于抗休克、消腫和解毒，所以在醫學上十分重要。莢膜比菌體要大。其染色原理是莢膜包圍在細菌細胞外面的一層粘液性物質，它是由多糖類衍生物、糖原或多肽所聚積而成，此層對染料結合力很弱，因此不易染色，故一般采用負染色的方法，使細菌和背景著色，背景與菌體之間形成一透明區即莢膜，便于觀察，由于莢膜很薄，容易變形，在制片是一般不用加熱固定。其步驟如下：方法一.⑴取鉀細菌一環，做成涂片，自然干燥（不能加熱干燥）；→⑵碳素墨水（用平整載玻片順菌液刮過）；→⑶風干；⑷甲醇固定；⑸水洗；→⑹蕃紅溶液1-2分鐘；→⑺自然干燥、鏡檢；→⑻結果：背景黑色、莢膜無色、菌體紅色。方法二.取少許菌苔與一滴無菌水，在玻片上混合，攤平，待自然風干后，用石炭酸復紅染液染2～3min，水洗（注意水不要直接沖洗涂菌處），用濾紙吸干。鏡檢，菌體紅色，莢膜為淡紅色。

五、繪圖：繪芽孢染色、莢膜染色的結果；六、預習：

放線菌、霉菌、酵母菌的形態觀察

實驗二十二放線菌、霉菌、酵母菌的形態觀察一、實驗的目的學習和掌握觀察放線菌、霉菌形態的基本方法，并觀察它們的個體形態特征。二、實驗原理

1、放線菌：放線菌是介于細菌與絲狀真菌之間而又接近于細菌的一類絲狀原核生物，因菌落呈放射狀而得名。

放線菌的菌落在培養基上著生牢固，不易被接種針挑取，由于孢子的存在，常使菌落表面呈粉末狀。它和細菌單染色一樣，可用石炭酸復紅和呂氏美藍等染料著色后，在顯微鏡下觀察它們的形態。放線菌是由不同長短的纖細的菌絲所組成的單細胞菌絲體，菌絲內無隔膜，菌絲體分為兩部分，即潛入培養基中的營養菌絲（基內菌絲）和有營養菌絲向上生長的氣生菌絲，有些氣生菌絲分化成各種孢子絲，呈螺旋狀、波浪形或分枝狀等，著生形式有叢生、互生和輪生三種。孢子的表面光滑或粗糙，圓或橢圓和干形。孢子有各種顏色。這些形態特點都是鑒別放線菌的重要依據。

⑴營養菌絲：又叫初級菌絲體或一級菌絲體，匍匐生長于培養基內，主要生理功能是吸收營養物，故亦稱基內菌絲。營養菌絲一般無隔膜，直徑0.2—0.8μ，但長度相差很大，短的小于100μ，長的可達600μ以上，有的無色素，有的產生黃、橙、紅、紫、蘭、綠、褐、黑等不同色素，若是水溶性的色素，還可透入培養基內，將培養基染上相應的顏色，如果是非水溶性（脂溶性）色素，則使菌落呈現相應的顏色，因此，色素是鑒定菌種的重要依據。⑵氣生菌絲：又稱二級菌絲體。營養菌絲體發育到一定時期，長出培養基外并伸向空間的菌絲為氣生菌絲。⑶孢子絲：當氣生菌絲體發育到一定程度，其上分化出可形成孢子的菌絲即孢子絲，又名產孢絲或繁殖絲。放線菌最突出的特性之一是產生大量的、種類繁多的抗生素，根據估計，全世界共發現4000多種抗生素，其中絕大部分是由放線菌產生的。2、霉菌：霉菌是一些“絲狀真菌”的統稱，不是分類學上的名詞。凡是在基質上長成毛狀、棉絮狀或蜘蛛網狀的絲狀真菌統稱霉菌。霉菌形態比細菌、放線菌復雜，個體比較大，具有分枝的菌絲體和分化的繁殖器官。因此，在觀察是要注意菌絲的直徑大小，菌絲體有無隔膜，營養菌絲有無假根，無性繁殖或有性繁殖時形成的孢子是哪一種，孢子是怎樣著生的。由于霉菌的菌絲較粗大，而且孢子容易飛散，如將菌體置于水中容易變形，故觀察時狀不用水浸法制片，而將菌體置于乳酸石炭酸棉蘭染液中，使細胞不易干燥，并有殺菌作用。三、材料1、菌種：5406放線菌、青霉菌、黑曲霉、根霉、酵母菌；2、染料：石炭酸復紅、0.1%呂氏美藍、乳酸石炭酸棉蘭；3、器材：載玻片、蓋玻片、酒精燈、鑷子、接種針、接種鏟等。四、方法及步驟1、放線菌：用接種鏟切取5406放線菌一塊（帶有培養基）→在載玻片上輕壓一下，棄去培養基，制成印