第2節微生物的培養技術和應用二、微生物的選擇培養和技術1、實例：DNA多聚酶鏈式反應(PCR)是一種在體外將少量DNA大量復制的技術，此項技術要求使用耐高溫（93℃）的DNA聚合酶。什么是TaqDNA聚合酶？從哪里獲得？如何獲得Taq細菌?2、實驗室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。一、選擇培養基選擇培養基：在微生物學中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基。稀釋涂布法是將菌液進行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞，從而能在培養基表面形成單個菌落。稀釋涂布平板法二、微生物的選擇培養微量移液器滴灼涂稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍各梯度分別涂布3個平板1個不涂布作空白對照待涂布的菌液被培養基吸收后，將平板倒置，放在30-37℃恒溫箱中培養1-2d，平板上就可以觀察到單菌落。常用方法：1、稀釋涂布平板法（也叫活菌計數法、間接計數法）原理：成功統計菌落數目的關鍵是恰當的稀釋度。當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。稀釋涂布平板法、顯微鏡直接計數法、濾膜法三、微生物的數量測定②為了保證結果的準確，一般選擇菌落數在30—300的平板進行計數，若設置的重復組中結果相差太遠，意味著操作有誤，需重新實驗。

計算公式每克樣品中的菌落數＝×M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數。①設置重復組，目的是增強實驗的說服力與準確性。將待測樣品經一系列10倍稀釋，然后選擇三個稀釋度的菌液，分別取0.1ml接種到已制備好的平板上，然后用無菌涂布器將菌液涂布在整個平板表面，放在適宜的溫度下培養計數菌落數。操作為使結果接近真實值，可將同一稀釋度菌液加到三個或三個以上的平板上，經涂布培養，計算出菌落平均數。

注意事項①為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30——300的平板上進行計數。②為使結果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經涂布，培養計算出菌落平均數。③統計的菌落往往比活菌的實際數目低。？是因為當2個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此，統計結果一般用菌落數表示而不用活菌數來表示。④涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個稀釋度中的第二個稀釋度所出現的平均菌落數在50個左右為最好。思考題1.想一想，如何從平板上的菌落數推測出每克樣品中的菌落數？答：統計某一稀釋度下平板上的菌落數，最好能統計3個平板，計算出平板菌落數的平均值，然后按課本旁欄的公式進行計算。例：某同學在稀釋倍數為106的培養基中測得平板上菌落數的平均值為234，那么每克樣品中的菌落數是(涂布平板時所用稀釋液的體積為0.1mL)多少？每克樣品中的菌落數=(C÷V)×M=(234/0.1)×106＝2.34×1092、顯微鏡直接計數法（1）原理：此法利用特定細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物數量。（2）方法：用血細胞計數板計數。計數板是特制的載玻片，其上有特定的面積為1mm2，高為0.1mm的計數室，一個計數室又被分成25個（或16個）中格，每個中格再被分成16個（或25個）小格，每個計數室都由400個小格組成。（3）操作：將稀釋的樣品滴在計數板上，蓋上蓋玻片，然后在顯微鏡下計數4~5個中格中的細菌數，并求出每個小格所含的細菌數，再按計數公式求出每毫升樣品中所含的細菌數。（4）計算公式（5）缺點：不能區分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；3、濾膜法以測定飲用水中大腸桿菌的數目為例。將已知體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放在伊紅美藍培養基上培養。在該培養基上，大腸桿菌的菌落呈現黑色。可以根據培養基上黑色菌落的數目，計算出水樣中大腸桿菌的數量。大腸桿菌菌落呈黑色或深紫色,有金屬光澤原理：伊紅—美藍培養基(EMB)是鑒別培養基，可以用來檢測自來水中的大腸桿菌是否超標，因為大腸桿菌的代謝產物與伊紅—美藍結合，使菌落呈深紫色或黑色并帶有金屬光澤，使大腸桿菌的菌落顯示出來，并沒有促進大腸桿菌的生長和抑制其他微生物的生長。到社會中去練習：我國規定每升飲用水中大腸桿菌不能超過3個。某興趣小組嘗試對某品牌飲用水的大腸桿菌含量進行檢測，操作簡圖如圖甲，伊紅美藍培養基配方如圖乙。回答下列相關問題：（1）圖甲中濾膜的孔徑應

（“大于”或“小于”）大腸桿菌。受此啟發，對某些不耐高溫的試劑可以怎樣除菌？（2）配制圖乙中的基礎培養基時，除了水分、無機鹽以外，還應加入

（一種營養成分），以及

。伊紅美藍培養基上生長的大腸桿菌菌落呈現

。（3）該小組通過統計黑色菌落的數目，計算出單位體積樣品中大腸桿菌數目。理論上他們的統計值要比實際

（“偏高”或“偏低”），理由是

？

（4）如圖所示的操作是培養基配置過程中的倒平板，該操作的正確使用順序是

（用圖中的序號和箭頭表示）。③步驟操作的目的是

。小于用濾膜過濾除菌氮源瓊脂黑色偏低兩個或多個大腸桿菌連在一起時，平板上只能觀察到1個菌落④→①→②→③既可使培養基表面的水分更好地揮發，又可防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染1、尿素的利用尿素是一種重要的農業氮肥。尿素不能直接被農作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細菌利用尿素的原因土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+CO22NH3+H2O四、探究實踐土壤中分解尿素的細菌的分離與計數（一）課題背景3、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。（二）課題目的①從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌②統計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌在以尿素為唯一氮源的選擇培養基上，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發育繁殖，從而受到抑制，所以用此培養基就能夠選擇出分解尿素的微生物。（三）實驗原理（四）實驗流程土壤取樣、制備培養基、樣品稀釋、取樣涂布、微生物培養、觀察并記錄結果、細菌計數、對分離的菌種做進一步鑒定土壤取樣從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。◆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。（五）實驗的具體操作步驟如下制備培養基設計一種選擇培養基，用尿素作為唯一氮源，可以將分解尿素的細菌分離出來。15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4土壤中分解尿素的細菌的分離與計數培養基配方：①從物理性質看此培養基屬于哪類？從功能上屬于哪類培養基？該培養基是否有選擇作用？固體培養基②在此培養基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素選擇培養基③該培養基與普通培養基有哪些共同點和不同點？此培養基只是用尿素作為唯一氮源，培養基的其它營養成分基本相同。將10g土樣加入盛有90mL無菌生理鹽水的錐形瓶中（錐形瓶體積為250mL），充分搖勻，吸取上清液1mL，轉移至盛有9mL的生理鹽水的無菌大試管中，依次等比稀釋至107稀釋度。

樣品稀釋由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數為103～107。每個稀釋度下需要3個選擇培養基，1個基礎培養基，因此共需要15個選擇培養基，5個基礎培養基。此外，還需要準備8個滅菌的試管和1個滅菌的移液管。◆應在火焰旁稱取土壤10g。◆在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行為什么分離不同的微生物采用不同的稀釋度？原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數在30～300之間、適于計數的平板。測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數量，選用的稀釋范圍相同嗎？為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養的條件。微生物的種類土壤稀釋倍數目標分離土壤中所有細菌104、105、106平板上的菌落數應為30～300個，便于準確計數。分離土壤中的放線菌103、104、105分離土壤中的真菌102、103、104分離土壤中的尿素細菌104、105、106、107按照由107～103稀釋度的順序分別吸取0.1mL進行平板涂布操作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。

取樣涂布◆如果得到了2個或2個以上菌落數目在30——300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數，如果同一稀釋倍數的三個重復的菌落數相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。◆實驗時要對培養皿作好標記。注明培養基類型、培養時間、稀釋度、培養物等。

微生物的培養與觀察培養不同微生物往往需要不同培養溫度。微生物的種類培養溫度培養時間觀察時間細菌30～37℃1～2d①每隔24h統計一次菌落數，選取菌落數目穩定時的記錄作為結果，以防止因培養時間不足而導致遺漏菌落的數目。②仔細觀察并記錄菌落的（形狀、大小、隆起程度和顏色等）特征。霉菌25～28℃3～4d放線菌25～28℃5～7d將涂布好的培養皿放在某（如：30℃）溫度下培養。隨著培養時間的延長，會有不同的菌落產生。觀察記錄比較基礎培養基和選擇培養基中菌落的數量、形態、大小、邊緣、突起、顏色、質地等等，并做好記錄。

細菌計數當菌落數目穩定時，選取菌落數在30～300的平板進行計數。在同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復計數，然后求出平均值，并根據平板所對應的稀釋度計算出樣品中細菌的數目。對分離的菌種做進一步鑒定挑選選擇培養基中不同形態的菌落接入含酚紅培養基的斜面中，觀察能否產生如圖的顏色反應。因為在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑，培養某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。

進一步探究五、結果分析與評價（一）培養物中是否有雜菌污染以及選擇培養基是否篩選出菌落

對照培養基在培養過程中沒有菌落生長，說明培養基沒有被雜菌污染。基礎培養基的菌落數目明顯大于選擇培養基的數目，說明選擇培養基已篩選出一些菌落。（二）是否獲得了某一稀釋度下菌落數為30-300的平板？如果得到了2個或2個以上菌落數目在30～300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數。如果學生選取的是同一種土樣，統計的結果應該接近。如果結果相差太遠，需要進一步分析產生差異的原因。（三）你的統計結果與其它同學的統計結果是否接近？如果相差很大，可能是什么原因造成的？拓展應用1：反芻動物，如牛和山羊，具有特殊的器官——瘤胃。在瘤胃中生活著多種微生物，其中許多微生物能以尿素作唯一氮源。請你設計一個實驗，從瘤胃中分離出能夠分解尿素的微生物。提示：反芻動物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會死亡，因此分離其中能分解尿素的微生物除了需要準備選擇培養基外，還應參照厭氧菌的培養方法進行實驗設計。下列哪一項操作達不到實驗目的？A.以尿素為唯一氮源B.以葡萄糖作為碳源C.將培養基調至酸性D.培養環境有充足氧氣拓展應用2：分解纖維素的微生物的分離纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是含量最豐富的多糖類物質。植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖維素。

棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產物。土壤中某些微生物能夠產生

,把纖維素分解為

，后再利用。纖維素酶葡萄糖2.纖維素酶

纖維素酶是一種

，一般認為它

，即

，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纖維素復合酶至少包括三種組分C1酶、和葡萄糖苷酶CX酶濾紙崩潰法3、纖維素分解菌的篩選（1）篩選纖維素分解菌的方法______________。該方法可以通過________反應直接篩選。剛果紅染色法顏色（2）原理：剛果紅是一種染料，它可以與纖維素形成紅色復合物，但并不和纖維二糖、葡萄糖發生這種反應。在含有纖維素的培養基中加入剛果紅時，剛果紅與纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素酶分解后剛果紅—纖維素的復合物就無法形成，培養基中會出現以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣我們可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。可根據是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌1.實驗原理纖維素酶是一種復合酶，一般認為它至少包括三種組分，即CX酶、

C1酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。剛果紅染色法：這種方法能夠通過顏色反應直接對微生物進行篩選.

剛果紅是一種染料，它可以與纖維素形成紅色復合物，但并不和纖維二糖、葡萄糖發生這種反應。當纖維素被纖維素酶分解后剛果紅—纖維素的復合物就無法形成，培養基中會出現以纖維素分解為中心的透明圈。這樣我們可以通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌.現在要從土壤中分離纖維素分解菌，請你給出詳細的實驗方案。實驗設計土壤取樣選擇培養梯度稀釋將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養基上挑選產生透明圈的菌落2.實驗流程3.實驗步聚（1）土壤取樣（2）選擇培養選擇培養基的制備選擇培養的操作（3）梯度稀釋制備菌懸液制備鑒別纖維素分解菌的培養基（4）將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養基上倒平板涂布平板剛果紅染色法（5）挑選產生透明圈的菌落取樣的環境是怎樣的，作出這種選擇的理由是什么？（為什么要在富含纖維素的環境中尋找纖維素分解菌？）

選擇纖維素豐富的環境，如樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等等。生物與環境的互相依存關系，在富含纖維素的環境中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環境。（1）土壤取樣人工設置適宜環境，使纖維素分解菌相對聚集。將濾紙埋在土壤中有什么作用？將紙埋于深約10cm的腐殖土壤中。你認為濾紙應該埋進土壤多深？為什么？根據樹葉腐爛程度推測出的，一般埋10cm左右，能使纖維素分解菌相對聚集。其次，纖維素分解菌是一類細菌，有的好氧，有的不好氧，所以這個深度不會太深或太淺。選擇培養的目的：增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物制備選擇培養基a、配方是液體培養基還是固體培養基？為什么？b、這個培養基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進行選擇的？c、你能否設計一個對照實驗，說明選擇培養基的作用？是液體培養基，原因是配方中無凝固劑有選擇作用，本配方中的碳源是纖維素粉，為唯一碳源，所以能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。用牛肉膏蛋白胨培養基與之對照或者將纖維素改為葡萄糖。（2）選擇培養

d、配方中的酵母膏也能夠提供少量的碳源，會對纖維素分解菌的培養造成怎樣的影響？由于酵母膏的含量極少，其他微生物也能在該培養基中生長繁殖，但很少。然而，只有以纖維素為碳源的微生物才能大量繁殖。在選擇培養的條件下，可以使那些能夠適應這種營養條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應這種營養條件的微生物的繁殖被抑制，因此選擇培養可以起到“濃縮”所需微生物的作用。為什么選擇培養能夠“濃縮”所需的微生物？具體操作選擇培養基的制備按配方配制，在250ML錐形瓶中裝入30ML培養基，用紗布做成瓶塞，瓶塞外包裹包裝紙，扎緊，高壓蒸汽滅菌。選擇培養的操作稱取土樣20g，在無菌條件下，將土樣加入裝有30ml選擇培養基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下振蕩培養1～2天，直至培養液變渾濁。吸取一定量的培養液，轉移至新的選擇培養基中，同樣培養至變渾濁。振蕩培養的目的？增加溶解氧，為目的菌提供O2制備鑒別纖維素分解菌的培養基（4）將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養基上培養基組成提供的主要營養物質CMC-Na(水溶性羧甲基纖維素鈉)5~10g碳源酵母膏1g碳源、氮源、生長因子KH2PO40.25g無機鹽土豆汁100mL碳源、生長因子瓊脂15g凝固劑上述物質溶解后，加蒸餾水定容至1000mL氫元素、氧元素鑒別纖維素分解菌的培養基配方

制備菌懸液按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養后的培養液進行等比稀釋，稀釋最大倍數到106（3）梯度稀釋倒平板涂布平板將稀釋度為104～106的菌懸液各取0.1ml涂布在培養基上，30℃倒置培養，至菌落長出。每個稀釋度下涂布3個平板，設置對照。剛果紅染色法