食品酶學第1章緒論主要內容1.1酶的定義與特征1.2酶學研究簡史1.3酶的分類和命名1.4酶學對食品科學的重要性1.1酶的定義與特征1.1.1酶的定義酶是由生物活細胞所產生的、具有高效和專一催化功能的生物大分子。（1）高效性同一反應，酶催化反應的速度比一般催化劑催化的反應速度要大107～1013倍。有極少量酶就可催化大量反應物發生轉變。1.1.2酶的特征例如，鐵離子和過氧化氫酶都可以催化雙氧水（H202）分解成為水和氧氣。在一定條件下，1mol鐵離子可催化6×10-4mol雙氧水分解。在相同條件下，1mol過氧化氫酶卻可催化5×106mol的雙氧水分解。過氧化氫酶的催化效率達到鐵離子的1010倍。（2）酶的專一性一種酶僅能作用于一種物質，或一類分子結構相似的物質，促其進行一定的化學反應，產生一定的反應產物，這種選擇性作用稱為酶的專一性。①絕對專一性這類酶對底物的要求很嚴格，甚至有時只能催化一種底物，進行一種化學反應。例如：過氧化氫酶只能催化過氧化氫的分解。琥珀酸脫氫酶只能催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸。②

相對專一性有些酶要求底物具有一定的化學鍵，對一類底物起作用，催化一類反應。例如：淀粉酶只能催化淀粉糖苷鍵的水解；蛋白酶只能催化蛋白質肽鍵的水解。③

立體異構專一性幾乎所有的酶對于立體異構體都具有高度的專一性。即酶只能催化一種立體異構體發生某種化學反應，而對另一種立體異構體則無作用。例如：L-氨基酸氧化酶只能作用于L-氨基酸。乳酸脫氫酶能催化L-乳酸脫氫變為丙酮酸，對D-乳酸則無作用。（3）高度受控性無論在體內或體外，酶的催化活力都受到多種因素的調節和控制。如基因表達、輔助因子、存在狀態、反饋抑制、底物水平、激素水平、激活劑、抑制劑、溫度、pH、酶原激活等。（4）易變性大多數酶是由生物活細胞產生的有催化能力的蛋白質，只要不是處于變性狀態，無論是在細胞內還是細胞外都可發揮催化作用。紫外線、熱、表面活性劑、重金屬鹽以及酸堿變性劑等能使蛋白質變性的因素，往往也能使酶失效。酶本身能被水解蛋白質的蛋白質水解酶分解而喪失活性。（5）代謝相關性生物體內幾乎所有的新陳代謝反應都需要酶的參與，對酶的任何改變都會影響甚至改變該酶參與的生物代謝過程。1.1.3食品酶學的定義酶學是研究酶的性質、酶的作用規律、酶的結構和作用原理、酶的生物學功能及酶的應用的一門科學。食品酶學是酶學的基本理論在食品科學與技術領域中應用的科學，是酶學的重要分支學科。主要研究食品原理、食品產品中酶的性質、結構、作用規律以及對食品儲藏、加工和食用品質的影響，食品級酶的生產及其在食品儲藏、加工等環節的應用理論與技術。1.2酶學研究簡史酶學重要性化學醫學生物工程生理學微生物學生物化學酶輕工、化工食品、醫藥能源、環保1.2.1人類利用酶的催化作用的歷史悠長而久遠⑴遠在進入游牧生活時期，人類已開始利用動物的胃液（含凝乳酶）來凝固牛乳，制造干酪。⑵中國早在4000年前的夏禹時代就已掌握了用麴和蘗釀酒的技術。《書經》中有“若作酒醴，爾維麴蘗”的記載。⑶在周朝（3000多年前），中國人民就會利用麥曲將淀粉降解為麥芽糖制造飴糖。(4)約2500年前的春秋戰國時期，人們已懂得利用酒曲來治療腸胃病，用雞內金（雞胃膜）治療消化不良。⑸人們還利用糞便使獸皮脫毛，制作皮革；用胰臟軟化皮革，這些都屬于酶的作用。1.2.2酶的發現（1）1833年法國化學家Payen和Persoz從麥芽汁提取物中首次發現了淀粉酶。（2）到19世紀中期，科學家們已陸續發現了胃蛋白酶、多酚氧化酶、過氧化物酶和轉化酶等。

巴斯德主張：發酵和活細胞有關，酒精發酵是酵母細胞生活的結果。巴斯德（1822-1895）微生物學的奠基人提出分子不對稱性理論，開創了立體化學研究的途徑。創立了發酵的生物學理論，低溫消毒技術（巴氏殺菌）免疫學--預防接種，研制出狂犬疫苗李比希認為：發酵及其他類似過程，是由于化學物質的作用，純粹是化學過程。李比希(1803—1873)德國化學家化學教育改革家有機化學創始人農業化學之父（3）關于發酵本質的長期論戰從1901年到1910年最早的十次諾貝爾化學獎獲得者中，李比希的學生就有七位。（4）1897年，畢希納兩兄弟(EduardBuchner&HansBuchner)成功的從酵母細胞分離出具有發酵作用的物質，能使糖發酵。這說明巴斯德和李比希的兩種觀點實質上是一致的。生物化學就是在解決發酵本質的著名論戰中產生的。HansBuchner（1850-1902）德國細菌學家EduardBuchner(1860-1917)1907年諾貝爾化學獎Enzyme的詞源1878年，德國科學家Kuhne首先提出用以表示未統一名稱的已知的各種酵素——enzyme。Enzyme本身的意思是“在酵母中”，起源于希臘語，其中en表示“在之內"，zyme表示酵母。1.2.3酶催化的專一性

1894年，Fischer提出了“鎖和鑰匙”模型，成功解釋了酶的催化反應機制。1959年，Koshland提出的“誘導契合”理論，以解釋酶的催化理論和專一性，同時也搞清了某些酶的催化活性與生理條件變化有關。1902年，Henri提出了酶與底物作用的中間復合物學說。1913年，Michaelis和Menten提出中間產物學說，推導出酶促反應動力學方程，即著名的米氏方程：

V=Vmax[S]/Km+[S]1.2.4酶學的理論研究1926年，美國人Sumner首先從刀豆中獲得了不負載任何其他催化劑的脲酶結晶，證明脲酶具有蛋白質性質。1930年至1936年間，制取了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶結晶。從此確立了酶的化學本質是蛋白質的觀點，為酶的理化特性研究奠定了基礎。1960年，操縱子學說的提出闡明了酶生物合成的基本調節機制。1965年，Philips首次用X射線晶體衍射技術闡明了雞蛋清溶菌酶的三維結構，為以后酶結構、功能以及催化機制的研究奠定了良好的基礎。20世紀80年代，Cech和Altman分別發現了具有催化功能的RNA-核酶，這一發現打破了酶是蛋白質的傳統觀念，開辟了酶學研究的新領域。1.2.5酶的固定化1953年，德國科學家Grubhofer和Schleith首先將聚氮基苯乙烯樹脂重氮化，將淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶結合在樹脂上，制成固定化酶，有效地進行了酶的固定化研究。1969年日本的千畑一郎首次在工業上應用固定化氨基酰化酶從DL-氨基酸生產L-氨基酸。美國在20世紀70年代初開始采用固定化酶技術，使玉米淀粉經酶法液化、糖化和異構化后，成功地工業化生產第一代、第二代和第三代高果糖漿，代替蔗糖作為可口可樂和百事可樂等飲料食品的甜味劑，提高了飲料質量，是一項非常成功的技術創新。1971年，出現了固定化菌體技術，70年代后期人們開始運用固定化細胞技術生產胞外酶。80年代中期，固定化原生質體技術則被用于生產胞內酶，以去除細胞壁擴散的障礙。酶固定化技術的發展也引起了食品、發酵工業一場大變革。目前為止，已發現自然界存在的酶有3000多種，但真正形成工業規模生產的只有幾十種。1.2.6酶工程的發展

酶工程就是將酶或者微生物細胞，動植物細胞，細胞器等在一定的生物反應裝置中，利用酶所具有的生物催化功能,借助工程手段將相應的原料轉化成有用物質并應用于社會生活的一門科學技術。1969年，日本的千畑一郎首次在工業上應用固定化氨基酰化酶從DL-氨基酸生產L-氨基酸后，學者們開始用“酶工程”這個新名詞來代表有效地利用酶的科學技術領域。而近20多年來，在酶和細胞固定化技術發展的同時，其他酶分子修飾技術也在不斷發展進步。此外，酶的化學合成、人工模擬，以及各種酶的應用技術研究，使酶工程不斷向廣度和深度發展，顯示出廣闊而誘人的前景。1.2.7基因工程技術對酶學的影響20世紀80年代基因工程技術誕生以來，對酶學的研究與應用技術也產生了深刻的影響。基因工程技術不但促進了基礎酶學的研究，如酶基因的克隆、酶催化機理的研究等，同時也促進了酶在食品工業中的應用，奠定了現代食品酶學的重要發展方向。1.3酶的分類和命名1.3.1酶的命名及面臨問題1833年Payen和Persoz發現麥芽提取液的酒精沉淀物中包含一種熱敏性物質可將淀粉水解變為糖，由于其能從不可溶的淀粉顆粒中分離出可溶性的糊精，他們將此物質命名為“diastase”，意思是“分離”（中文現譯為“淀粉酶”），這樣隨意的方式成為酶命名的開端，后來命名一種酶時常加詞尾“ase”。在隨后的很長一段時間里，出現了各種各樣的命名方式。有根據純化后酶的顏色來命名的，如老黃酶（oldyellowenzyme）；有根據酶的來源命名的，如無花果蛋白酶（ficin），胃蛋白酶（pepsin）；有根據酶作用的底物來命名的，如果膠酶（pectase）。問題：命名混亂；一酶數名或一名數酶；不能體現酶所催化反應的特性；1.3.2酶學委員會提出的命名規則酶學委員會提出以酶所催化的化學反應性質作為酶的分類和命名規則的主要依據，每一種酶都給以三個名稱：慣用名，系統名和一個數字編號。慣用名不需要非常的精確，要求比較簡短，使用方便；一般根據酶所作用的底物名稱、催化的反應性質、酶的來源或其他特點來進行命名。系統名要求能確切地表明底物的化學本質及酶的催化性質；包括兩部分，底物名稱及反應類型；若酶催化的反應中有兩種底物起反應，則這兩種底物均需表明，當中用“：”隔開。若底物之一是水時，可將水略去不寫。例：多酚氧化酶其系統名稱為：1,2-苯二酚：氧-氧化還原酶。數字編號系統根據酶所催化反應的類型將酶分為6大類，并以4個阿拉伯數字來對每一種酶進行編號。例如乙醇脫氫酶，編號為EC1.1.1.1。EC是指酶學委員會（EnzymeCommission）。第一個數字代表酶的6個大分類，以1，2，3，4，5，6來分別代表如下6大酶類：（1）氧化還原酶（Oxidoreductases）催化氧化還原反應；（2）轉移酶（Transferases）催化分子間基團轉移的反應；（3）水解酶（Hydrolases）催化水解反應；（4）裂合酶（Lyases）催化非水解地除去底物分子中的基團及其逆反應；（5）異構酶（Isomerases）催化分子的異構反應；（6）合成酶（synthetases）催化兩分子連接的反應。1.3.3同工酶的命名

同工酶是指在生物體內或組織中催化相同反應而具有不同分子形式（包括不同的氨基酸序列、空間結構等）的酶。國際生化協會同工酶分委員會建議同工酶的名稱根據他們在電泳中分離的位置確定，從電泳中向著陽極移動最遠的酶開始依次編號。1.4.1酶對食品加工和保藏的重要性（1）控制食品原料中的酶活力有效改善食品原料的風味和質地結構（2）利用酶的催化活性進行食品加工及保藏1.4酶學對食品科學的重要性葡萄糖氧化酶作為除氧劑普遍應用于食品保鮮及包裝中，延長食品保質期。溶菌酶在食鹽、蔗糖等溶液中穩定，耐酸耐熱性強，是天然安全的食品防腐劑。1.4.2酶對食品安全的重要性（1）通過基因工程手段改造部分微生物基因，改變酶蛋白的基本結構，達到強化酶在某方面功能特性的做法給食品酶的應用帶來安全隱患。（2）酶作用會使食品品質特性發生改變，有可能會產生毒素和其他不利于健康的有害物質。如果將加入食品中的酶看作為食品添加劑，那么就應該考慮到衛生和安全方面的問題。（3）利用酶法解毒。例如，利用乳糖酶預先處理乳制品，可以有效緩解或消除人體因消化乳糖困難而引起的胃脹氣、腹痛、嘔吐或拉肚子等癥狀。1.4.3酶對食品營養的重要性（1）酶作用有可能導致食品中營養組分的損失。（2）利用酶作用去除食品中的抗營養素，提高食品的營養價值，使食品中的營養元素更利于人體的吸收利用。1.4.4酶對食品分析的重要性酶法分析具有準確、快速、專一性和靈敏性強等特點，其中最大優點就是酶的催化專一性強。酶法分析的樣品一般不需要進行很復雜的預處理，尤其適合食品這一復雜體系。1.4.5酶與食品生物技術食品生物技術是生物技術的重要分支學科，主要研究基因工程、細胞工程、酶工程、發酵工程在食品工業上的應用。酶工程的主要研究內容是把游離酶固定化，或者把經過培養發酵產生目的酶活力高峰時的整個微生物細胞再固定化，然后直接應用于食品生產過程中物質的轉化。酶不僅作為一類重要的研究對象，同時也作為重要的研究工具。課后思考1、酶的特性有哪些？2、國際酶學委員會推薦的分類和命名規則的主要依據是什么？3、酶對食品科學的重要性表現在哪些方面？第2章酶的生產與分離純化主要內容

2.1國內外酶制劑工業生產及應用現狀

2.2酶的發酵生產

2.3酶的分離純化

2.4酶分離、純化的評價

2.5酶的劑型與保存

工業酶制劑的主要來源：動物：豬胰蛋白酶、胃蛋白酶植物：木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、麥芽淀粉水解酶微生物：酶的主要來源2.1國內外酶制劑工業生產及應用現狀

目前工業應用的三大主要酶制劑：淀粉酶——烘焙、釀造、淀粉糖化、紡織業蛋白酶——去污劑、奶制品業、皮革業脂肪酶——去污劑、食品、精細化工2.1.2集中壟斷，市場全球化規模企業由20世紀80年代初的80多家減少至20多家，占市場90%丹麥諾和諾得公司（諾維信novozymes）→1978年進入中國諾維信公司，占50%市場（天津）；美國杰能科公司（Genencor）→98年進入中國，與無錫合資，控股80%（無錫），兩家公司銷售額占全球2/3；（2005年杰能科國際公司被丹尼斯克公司收購）；芬蘭科特公司和丹麥丹尼斯克公司酶制劑業務合并，Pfizer，Rhone，SKW,Biosystems，日本天野2.1.3品種、規模不斷擴大目前30多家600多個品種，應用于18個工業領域;我國2000年酶制劑產量為30萬噸，100家，市場份額僅占5%，以未經除菌去渣的粗制品粉狀酶為主;國際以液體、顆粒為主;國內糖化酶、ａ-淀粉酶、蛋白酶三大類占97%;重要產品普魯蘭酶、真菌淀粉酶、系列果膠酶、低溫堿性蛋白酶，國內尚未投入生產;我國有7家上市公司介入酶制劑開發生產。2.1.4應用領域不斷擴大美國酶制劑年產值6.25億美元，食品工業占62%，拓展飼料工業、洗滌劑工業、化學工業。2.2酶的發酵生產用于酶發酵生產的細胞需具備的條件：酶產量高容易培養和管理產酶穩定性好利于酶的分離純化安全可靠

利用微生物產酶的優點：(1)微生物種類多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。(2)微生物生長繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶。(3)微生物培養基來源廣泛、價格便宜。(4)可以采用微電腦等新技術，控制酶發酵生產過程，生產可連續化、自動化，經濟效益高。(5)可以利用以基因工程為主的現代分子生物學技術，選育菌種、增加酶產率和開發新酶種。2.2.1產酶微生物

菌種是發酵生產酶的重要條件。目前投入工業酶發酵生產的菌種約有50～60種，包括細菌、放線菌、酵母菌、霉菌。2.2.2酶的發酵技術2.2.2.1培養基培養基的營養成分是微生物發酵產酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是無機鹽、生長因子和產酶促進劑等。

（1）碳源碳源是指能夠向細胞提供碳素化合物的營養物質。也是提供能量的能源。碳素是構成細胞成分的主要元素之一，也是各種酶的重要組成元素。所以，碳源是酶發酵生產乃至其他產物的發酵生產必不可少的營養物質。碳源的選擇：不同細胞對碳源的利用情況；碳源對酶合成的調節作用；原料的供求和價格最常用的碳源：淀粉及其水解物，如糊精、麥芽糖、葡萄糖等。

（2）氮源氮是組成細胞蛋白質和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要組成元素。凡是能夠向細胞提供氮元素的營養物質都稱為氮源。酶制劑生產中的氮源主要有有機氮源和無機氮源兩種，有機氮源有：豆餅、花生餅、菜籽餅、魚粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；無機氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3PO4、尿素等。一般來說，動物細胞要求有機氮，植物細胞要求無機氮。異氧型微生物用有機氮，自養型微生物用無機氮。

（3）碳氮比在微生物酶生產培養基中碳源與氮源的比例是隨生產的酶類、生產菌株的性質和培養階段的不同而改變的。一般蛋白酶

(包括酸性、中性和堿性蛋白酶)生產采用碳氮比低的培養基比較有利；淀粉酶(包括α-淀粉酶、糖化酶、β-淀粉酶等)生產的碳氮比略高。

以上是蛋白酶和淀粉酶生產培養基碳氮比的一般規律，但是由于菌種很多而其性質各異。很難說都是符合上述規律的。

（4）無機鹽無機鹽的主要作用是提供細胞生命活動不可缺少的無機元素，并對培養基的pH、氧化還原電位和滲透壓起調節作用。根據細胞對無機元素需要量的大小可分為主要元素和微量元素兩大類。

（5）生長因子生長因子是指細胞生長繁殖所必不可缺的微量有機化合物，主要包括各種氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶等。酶制劑生產中所需的生長因子，大多是由天然原料提供，如玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、酵母膏、麩皮、米糠等。

（6）產酶促進劑產酶促進劑是指在培養基中添加某種少量物質，能顯著提高酶的產率，這類物質稱為產酶促進劑。產酶促進劑大體上分為兩種：誘導物和表面活性劑。產酶誘導物一般是酶作用的底物或底物類似物，或是誘導物的前體物質。生產上常采用非離子型表面活性劑，離子型的表面活性劑對微生物有害。

2.2.2.2發酵條件對產酶的影響(1)溫度對產酶的影響溫度是影響細胞生長繁殖和發酵產酶的重要因素之一。發酵溫度的變化主要隨著微生物代謝反應、發酵中通風、攪拌速度的變化而變化的。發酵初期合成反應吸收的熱量大于分解反應放出的熱量，發酵液需要升溫。當菌體繁殖旺盛時，情況則相反，發酵液溫度就自行上升，加上通風攪拌所帶來的熱量，這時，發酵液必須降溫，以保持微生物生長繁殖和產酶所需的適宜溫度。微生物生長繁殖和產酶的最適溫度隨菌種和酶的性質不同而異，二者往往不一致。如紅曲霉生長溫度35~37℃，而生產糖化酶的最適溫度為37～40℃。生長階段控制在最適生長溫度，以利于細胞生長繁殖；產酶階段，溫度控制在產酶最適溫度。(2)pH對產酶的影響種子培養基和發酵培養基的pH直接影響酶的產量和質量。細胞發酵產酶的最適pH通常接近該酶反應的最適pH。一般來說，培養基成分中碳/氮(C/N)比高，發酵液傾向于酸性，pH低；C/N低，發酵液傾向于堿性，pH高。在發酵過程中，微生物不斷分解和同化營養物質，同時排出代謝產物。這些產物都與pH有直接關系，因此發酵液pH在不斷發生變化。這些變化常常引起細胞生長和產酶環境的變化，對產酶帶來不利的影響。

生產中通常采用控制pH的方法：添加緩沖液維持一定的pH；調節通風量維持發酵液的氧化還原電位于一定范圍；調節培養基的初始pH，保持一定的C/N比；當發酵液pH過高時用糖或淀粉來調節，pH過低時，通過氮調節。(3)通風量對產酶的影響通風量的多少應根據培養基中的溶解氧而定。一般來說，在發酵初期，雖然幼細胞呼吸強度大，耗氧多，但由于菌體少，相對通風量可以少些；菌體生長繁殖旺盛期時，耗氧多，要求通風量大些；產酶旺盛時的通風量因菌種和酶種而異，一般需要強烈通風；但也有例外，通風量過多反而抑制酶的生成。目前用于酶制劑生產的微生物都為好氣性微生物，生產上普遍采用自動測定和記錄溶解氧的儀表。(4)攪拌的影響攪拌有利于熱交換、營養物質與菌體均勻接觸，降低細胞周圍的代謝產物，從而有利于新陳代謝。同時可打破空氣氣泡，使發酵液形成湍流，增加湍流速度，從而提高溶氧量，增加空氣利用。攪拌速度主要因菌體大小而異，由于攪拌產生剪切力，易使細胞受損。同時攪拌也帶來一定機械熱，易使發酵液溫度發生變化。攪拌速度還與發酵液黏度有關。(5)中間補料的影響中間補料是在發酵過程中補充某些營養物料，滿足微生物的代謝活動和合成發酵產品的需要。中間補料可促使微生物在培養中期的代謝活動受到控制，延長發酵產物的分泌期，推遲菌種的自溶期，維持較高的發酵產物增長幅度，并增加發酵體積，從而使單罐產量大幅度上升。(6)泡沫的影響泡沫的存在阻礙CO2的排除，影響溶氧量，同時泡沫過多影響補料，也易使發酵液溢出罐外造成跑料。消泡措施：機械消泡化學消泡

消泡劑主要是一些天然的礦物油類、醇類、脂肪酸類、胺類、酰胺類、醚類、硫酸酯類、金屬皂類、聚硅氧烷和聚硅酮。理想的消泡劑，其表面相互作用力應低，而且應難溶于水，還不能影響氧的傳遞速率和微生物的正常代謝。(7)濕度用固體培養基生產酶制劑時，一般前期濕度低些，培養后期濕度大些，有利于產酶。2.3酶的分離純化酶的分離純化目的在于獲得一定量的、不含或少含雜質的酶制品或者提純為結晶，以利于在科學研究或生產中的應用。酶的分離純化的一般步驟包括選材、細胞破碎、酶的抽提、分離、純化、結晶，以及酶的純度鑒定和保存。材料的選擇及前處理破細胞抽提濃縮與初步提純注意點除了少數例外，所有操作都應在低溫下條件下進行，尤其在有有機溶劑存在時更應特別小心大多數酶在pH<4或pH>10的情況下不穩定，故必須控制整個系統不要過酸或過堿；同時要避免在調節pH時產生局部酸堿過量的現象。酶和其它蛋白質一樣，常易在溶液表面或界面處形成薄膜而變性，故操作中應盡量減少泡沫形成。重金屬、有機溶劑等能使酶變性失效，微生物污染、蛋白水解酶的存在能使酶分解破壞，所有這些也都應予以足夠的重視。酶原料選擇的原則：酶含量多、干擾物質少；來源豐富、保持新鮮；容易得到、提取工藝簡單；穩定性好、安全性好；有綜合利用價值2.3.1酶原料的選擇2.3.2.1生物組織的破碎

(1)研磨法/組織搗碎法利用機械力的攪拌、剪切、研碎細胞。常用的有高速組織搗碎機、高壓勻漿泵、或直接用研缽研磨等。2.3.2酶的提取(2)超聲波法使用超聲波破碎儀所產生的超聲波（10-15kHz）機械震動后對組織細胞產生的空化作用使細胞破碎。主要問題：

超聲空穴局部過熱引起酶活性喪失，所以超聲振蕩處理的時間應盡可能短，容器周圍以冰浴冷卻處理，盡量減小熱效應引起的酶失活。(3)滲透壓法細胞在高滲溶液（如蔗糖溶液）中平衡一段時間后，突然轉入低滲溶液中，細胞壁由于滲透壓的突然變化而溶脹破碎。該方法對具有堅韌的多糖細胞壁的細胞，如植物、細菌和霉菌不太適用，除非用其他方法先除去這些細胞外層堅韌的細胞壁。(4)凍融法細胞在低溫冰凍后再在室溫融化，反復凍融就能使細胞壁破裂。所需設備簡單，普通家用冰箱的冷凍室即可進行凍融。一般需在凍融液中加入蛋白酶抑制劑，如PMSF(苯甲基磺酰氟)、絡合劑EDTA、還原劑DTT(二硫蘇糖醇)等以防破壞目的酶。(5)酶消化法利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶對細胞膜或細胞壁的酶解作用，使細胞崩解破碎。將革蘭氏陽性菌(如枯草桿菌)與溶菌酶一起溫育，就能得到易破碎的原生質體；幾丁質酶和3－葡聚糖酶則常用于水解曲霉、面包霉等的細胞壁。(6)化學破碎法應用各種化學試劑與細胞膜作用，使細胞膜的結構改變或破壞的方法。常用的化學試劑分為有機溶劑和表面活性劑兩大類。①有機溶劑處理常用的有機溶劑有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿。有機溶劑可使細胞膜的磷脂結構破壞，從而改變細胞膜的透過性，再經提取可使膜結合酶或胞內酶等釋出胞外。②表面活性劑處理表面活性劑可以和細胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用使細胞膜結構破壞，增加膜的透過性。丙酮干粉的制備破細胞等處理后可將材料制成丙酮干粉(acetonepowder)，一般程序是：先將材料粉碎、分散，然后在0℃以下的低溫條件下，加入5~10倍預先冷至約-20℃的丙酮。迅速攪拌均勻，隨即過濾，最后低溫干燥，研磨過篩。丙酮處理一方面能有效地破壞細胞壁，另一方面有利于除去大量的脂類雜質，同時還能使某些膜結合酶易于溶解。此外，丙酮干粉含水量低，便于保存。2.3.2.2酶的提取

酶的提取是指在一定條件下，用適當的溶劑處理含酶原料，使酶充分溶解到溶劑中的過程，也稱作酶的抽提。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中，要注意控制好溫度、pH值等各種條件。抽提劑由于大多數酶屬于球蛋白類，一般都溶于稀鹽、稀酸或稀堿溶液。但抽提液的具體組成和抽提條件的選擇取決于酶的溶解性、穩定性以及如何最有利于切斷酶和其他物質的聯系。

抽提液＝離子強度調節劑十pH緩沖劑＋溫度效應劑

(KCl、NaCl、蔗糖)(各種緩沖液)(甘油、二甲基亞砜)

＋蛋白酶抑制劑＋防氧化劑

(PMSF、DIFP)(DTT巰基乙醇)

＋重金屬絡合劑＋增溶劑

(EDTA、檸檬酸)(TritonX－100)典型的抽提液由以下幾部分組成：酶的主要提取方法(1)鹽溶液提取大多數酶溶于水，而且在一定濃度的鹽存在條件下，酶的溶解度增加，這稱之為鹽溶現象，然而鹽濃度不能太高，否則溶解度反而降低，出現鹽析現象。一般采用稀鹽溶液進行酶的提取，鹽濃度一般控制在0.02~0.5mol/L。α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mol/L的氯化鈉溶液或0.02~0.05mol/L的磷酸緩沖液提取；酵母醇脫氫酶用0.5~0.6mol/L的磷酸氫二鈉溶液提取；6-磷酸葡萄糖脫氫酶用0.1mol/L的碳酸鈉提取：枯草桿菌堿性磷酸酶用0.1mol/L的氯化鎂提取。(2)酸溶液提取有些酶在酸性條件下溶解度較大且穩定性較好，宜用酸溶液提取。例如，從胰臟中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，采用0.12mol/L的硫酸溶液進行提取。

(3)堿溶液提取有些在堿性條件下溶解度較大且穩定性較好的酶，應采用堿溶液提取。例如，細菌L-天門冬酰胺酶的提取是將含酶菌體懸浮在pH11~12.5的堿溶液中，振蕩20min，即達到顯著的提取效果。(4)有機溶劑提取有些與脂質結合比較牢固或分子中含非極性基團較多的酶，不溶或難溶于水、稀酸、稀堿和稀鹽溶液中，需用有機溶劑提取。常用的有機溶劑是與水能夠混溶的乙醇、丙酮、丁醇等2.3.3酶的純化

酶的分離純化工作主要是，將酶從雜蛋白中分離出來或者將雜蛋白從酶溶液中除去。現有酶的分離純化方法都是依據酶和雜蛋白在性質上的差異而建立的。

根據酶和雜蛋白的性質差異，它們的分離方法可分為：（1）根據分子大小而設計的方法。如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過濾法等。（2）根據溶解度大小分離的方法、如鹽析法、有機溶劑沉淀法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點沉淀法等。（3）按分子所帶正負電荷多少分離的方法，如離子交換分離法、電泳分離法、聚焦層析法等。（4）按穩定性差異建立的分離方法，如選擇性熱變性法、選擇性酸堿變性法、選擇性表面變性法等。（5）按親和作用的差異建立的分離方法，如親和層析法、親和電泳法等。酶的分離純化方法酶的分離純化方法等電點沉淀法原理：在低離子強度下，調pH至等電點，使蛋白質所帶靜電荷為零，降低了靜電斥力，而疏水能力使分子間相互吸引，形成沉淀。不同的酶和蛋白質等電點不同，可以使pH達到某種酶的等電點，使其沉淀與其他物質分離開來。優點：很多酶的等電點都在偏酸性范圍內，而無機酸通常價格較廉，并且某些酸（如磷酸、鹽酸和硫酸）的應用能為蛋白質類食品所允許。同時，也可直接進行其他純化操作，無需將殘余的酸除去。缺點：酸化時易使酶失活，這是由于酶對低pH比較敏感。

鹽析法低濃度的中性鹽可增加電解質類物質（蛋白質、酶及其復合物）的溶解度，被稱為鹽溶現象；但當鹽濃度繼續增加時，蛋白質的溶解度反而降低而沉淀出來，稱為鹽析。原理：鹽離子與酶和蛋白質分子爭奪水分子，減弱了酶和蛋白質的水合程度，使溶解度降低；鹽離子所帶電荷部分中和了酶和蛋白質分子上所帶電荷，使其靜電荷減少，酶和蛋白質也易沉淀。不同酶和蛋白質會在不同的中性鹽濃度下析出。在蛋白質的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。有機溶劑沉淀法原理：

加入有機溶劑于酶溶液中產生多種效應，這些效應結合起來，使酶沉淀。其中主要效應是水的活度的降低。當有機溶劑濃度增大時，水對酶分子表面上荷電基團或親水基團的水化程度降低，因而靜電吸力增大。在疏水區域附近有序排列的水分子可以為有機溶劑所取代，使這些區域的溶解性增大。但除了疏水性特別強的酶外，對多數酶來說，后者影響較小，所以總的效果是導致酶分子聚集而沉淀。

優點：

溶劑容易蒸發除去，不會殘留在成品中，因此適用于制備食品級酶。而且有機溶劑密度低，與沉淀物密度差大，便于離心分離。缺點：容易使酶變性失活，且有機溶劑易燃、易爆、安全要求較高。常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等。離心分離離心是借助于離心機旋轉所產生的離心力，使不同大小和不同密度的物質分離的技術，在酶的提取和分離純化過程中，細胞的收集、細胞碎片和沉淀的分離以及酶的純化等往往要使用離心分離。在離心分離時，要根據欲分離物質以及雜質的大小、密度和特性的不同，選擇適當的離心機、離心方法和離心條件。

按照離心機的最大轉速的不同可以分為常速(低速)、高速和超速三種。常速離心機的最大轉速在8000r/min以內，相對離心力(RCF)在1×104g以內，主要用于細胞、細胞碎片和培養基殘渣等固形物的分離。高速離心機的最大轉速為1×104~2.5×104r/min，相對離心力達到1×104g~1×105g，主要用于沉淀、細胞碎片和細胞器等的分離。超速離心機的最大轉速達2.5×104~8×104r/min，相對離心力可以高達5×105g。超速離心可以采用差速離心、密度梯度離心或等密梯度離心等方法。超速離心可用于酶分子的分離純化。透析與超過濾透析與超過濾技術是利用具有特定大小、均勻孔徑的透析膜或超濾膜的篩分機理，在不加壓（透析）或加壓（超過濾）的條件下把酶提取液通過一層只允許水和小分子物質透過的透析膜或超濾膜，酶等大分子物質被截流，從而達到把小分子物質從酶提取液中除去（透析與超過濾）或同時達到濃縮酶液（超過濾）的目的。凝膠層析凝膠層析有多種名稱，又稱凝膠排阻層析、分子篩層析法、凝膠過濾法等。根據溶質分子的大小進行分離的方法。根據多孔凝膠對不同大小分子的排阻效應不同而對物質進行分離純化的技術。優點：操作方便，不會使物質變性，層析介質不需再生，可反復使用等。由于凝膠層析劑的容量比較低，所以在生物大分子物質的分離純化中，一般不作為第一步的分離方法，而往往在最后的處理中被使用。它的應用主要包括脫鹽，生物大分子按分子大小分級分離以及分子量測定等。a.小分子由于擴散作用進入凝膠內部被截留；大分子被排阻在顆粒外，在顆粒間迅速通過。b.1.蛋白質混合物上柱，2.洗脫開始，小分子擴散進入凝膠顆粒內大分子被排阻在顆粒外，3.小分子被截留，大分子向下移動，大小分子分開，4.大小分子完全分開，5.大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在行進中。（1）凝膠過濾層析的原理①聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成凝膠，由丙烯酰胺與N，N－甲叉雙丙烯酰胺為交聯劑共聚而成。商品名是生物膠-P（Bio－GelP），有各種型號，P－后的數字乘以1000表示其分離的最大分子量(即排阻分子量)。(2)凝膠種類(2)凝膠種類②交聯葡聚糖凝膠是分子量幾萬到幾十萬的葡聚糖凝膠通過環氧氯丙烷交聯而成的網狀結構物質，可分離分子量從l000~500000的分子。商品名是SephadexG。還有一種通過N，N－甲叉雙丙烯酰胺交聯的聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠（Sephacryl－S)，可適用于水、有機溶劑及高濃度解離試劑存在的系統。另一類Sephadex－LH，適用于脂類化合物的分離。③瓊脂糖凝膠瓊脂糖是瓊脂抽去瓊脂膠等之后所得D－半乳糖和3，6－脫水半乳糖，自動締合而成的網眼結構物質，孔徑大小由膠的濃度決定。商品名為Sepharose.這類凝膠孔徑都比較大，適于分離較大的物質，如病毒、細胞顆粒和DNA等。離子交換層析離子交換層析是以纖維素或交聯葡聚糖凝膠等物的衍生物作為載體，在某一pH下，這些載體帶有正電荷或負電荷，而這時帶有相反電荷的酶分子若通過載體，由于靜電的吸引力，為載體所吸附。然后用電荷量更多，離子強度更高的緩沖液洗脫，通過離子交換作用使酶分子脫離載體而得以分離。離子交換劑由基質、電荷基團和反離子構成。基質與電荷基團以共價鍵相連，電荷基團與反離子以離子鍵結合。根據其反離子與交換離子的不同，可以把離子交換劑分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。當pH低于等電點時，蛋白質帶正電荷，能與陽離子交換劑結合；當pH高于等電點時，蛋白質帶負電荷，能與陰離子交換劑結合。常見的離子交換劑有DEAE-纖維素、DEAE-Sep