誘變物質的微核試驗實驗十一、十二實驗原理

微核（Micronucleus，MN）：當染色體受到損傷后，染色單體或染色體的無著絲粒斷片，或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細胞分裂后期，仍然游離在細胞質中。末期之后，單獨形成一個或幾個規則的次核，被包含在子細胞的胞質內，因比主核小，故稱為微核。微核試驗（Micronucleustest，MNT）

：凡能使染色體發生斷裂或使染色體和紡錘體聯結有損傷的化學物，都可用微核試驗來檢測。各種類型的骨髓細胞都可形成微核，但有核細胞的胞質少，微核與正常核葉及核的突起物難以鑒別。所以多用無主核的細胞來進行微核試驗。嗜多染紅細胞（polychromaticerythrocyte，PCE）：是分裂后期，處于幼年紅細胞向成熟紅細胞發展中間階段的一群紅細胞。此時的紅細胞主核已排出，但因胞質內含有核糖體，用姬姆薩染色呈灰藍色；成熟紅細胞的核糖體已消失，則被染成橘紅色；而幼紅細胞則有較大的核，且被染成紫紅色。骨髓中嗜多染紅細胞數量充足，微核被染成紫紅色或藍紫色，很容易辨認，而且微核自發率低。因此，骨髓中嗜多染紅細胞成為微核試驗的首選細胞群。成熟紅細胞嗜多染紅細胞幼紅細胞嗜多染紅細胞微核實驗目的1、了解微核發生的機制；2、掌握微核實驗的一般程序和實踐意義；3、掌握對實驗動物進行藥物處理的一般程序、方法和注意事項；4、掌握進行實驗設計的一般程序和規則，學會用生物統計學方法對實驗結果進行統計分析，并鍛煉實踐能力。儀器和器械

離心機、生物顯微鏡、解剖剪刀、鑷子、注射器、尖底刻度離心管、載玻片、蓋玻片、塑料吸瓶、吸水紙等。試劑及配制

（1）小牛血清（滅活）

將濾菌的小牛血清置于56℃恒溫水浴保溫30min滅活。滅活的小牛血清通常保存于冰箱冷凍室里。

（2）姬姆薩（Giemsa）染液（原液）

成分：Giemsa染料3.8g、甲醇 375mL、甘油125mL。

配制：將染料和少量甲醇于乳缽里仔細研磨，再加入甲醇至375mL和125mL甘油，混合均勻，放置37℃恒溫箱中保溫48h。保溫期間，振搖數次，促使染料充分溶解，取出后過濾，兩周后使用。（3）0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）成分：磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）71.64g/L（A液）

磷酸二氫鈉（NaH2PO4

·2H2O）31.21g/L（B液）分別加蒸餾水1000mL配成A、B液；取A液51ml,B液49ml混合，再加入100ml蒸餾水混勻，即為pH6.8的0.1mol/L磷酸緩沖液。（4）Giemsa應用液取2mlGiemsa染液原液與40ml0.1mol/L磷酸鹽緩沖液混合而成。臨用現配。實驗動物：

小鼠是微核試驗的常規動物。體重一般為25g~35g（也可選用成年大鼠，體重為150g~200g）。正常小鼠嗜多染紅細胞自發微核頻率為2.6‰，陽性物（一般用環磷酰胺150mg/kg體重劑量）對照組微核頻率為30.4‰。（斑馬魚微核頻率范圍為0.25‰

~1.2‰

）劑量分組：

每種受試藥物一般至少設3個劑量。每個劑量組5-10只動物。另外，還應設溶劑對照（陰性對照）和陽性物對照組。常用環磷酰胺作為陽性物對照，劑量可為40mg//kg體重（或150mg/kg體重）。如用斑馬魚（體重約0.5g，體長2.8~3.0cm

）測試水體污染物誘導微核的實驗，則陽性對照物為氟化鈉（NaF），劑量為30mg/kg。一般為腹腔或腹部皮下注射。受試物：秋水仙素，對苯二酚，氯化汞（以往實驗設計）受試物劑量mg/Kg組別各受試小鼠1000個受檢細胞中含微核細胞數1234567對苯二酚1201802403秋水仙素1015213氯化汞312213陰性對照蒸餾水陽性對照環磷酰胺(40mg/kg)受試物：秋水仙素，對苯二酚，氯化汞（本次實驗設計）受試物(濃度)劑量mg/30g/只組別各受試小鼠1000個受檢細胞中含微核細胞數1234567對苯二酚(1.2mg/ml)240(0.2ml)1480(0.4ml)2720(0.6ml)3秋水仙素(0.1mg/ml)20(0.2ml)440(0.4ml)560(0.6ml)6氯化汞(0.03mg/ml)6(0.2ml)112(0.4ml)218(0.6ml)3陰性對照蒸餾水0(0.2ml)7陽性對照(200mg/ml)環磷酰胺40(0.2ml)8染毒途徑和方式

染毒途徑視實驗目的而定，常用腹腔注射，24小時取材。

試驗方法（1）骨髓的制取

①用斷頸法處死小鼠。用剪刀剪開腿部的皮膚，用鑷子夾住小鼠的股骨，剪去股骨周圍的肌肉，將小鼠的兩股骨取出(注意股骨的完整性)，擦凈股骨上的肌肉。去股骨的髖面，將吸有0.85%Nacl生理等滲液小注射器的針頭插入，反復數次吹出骨髓細(注意吹干凈)。反復吹打使其混合均勻，制成細胞懸液。

②將細胞懸液在1000轉/分離心5分鐘，棄除上清液。（2）涂片在離心管中加入少量滅活的小牛血清（約0.3ml)混勻后，按血常規涂片法涂片，長度約2cm~3cm(涂片時一次涂成）。在空氣中晾干。（3）固定

將干燥的涂片放入無水甲醇液（或甲醇：冰乙酸=3:1的固定液）中固定5~10

min。即使當日不染色，也應固定后于冰箱中保存。（4）染色

將固定過的涂片放入Giemsa應用液中，染色20min~30min，然后立即用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗。（5）封片

用濾紙及時擦干染片背面的水滴，再用雙層濾紙輕輕按壓染片，以吸附染片上殘留的水分，再在空氣中晃動數次，以促其盡快晾干，然后放入二甲苯中透明5min，取出滴上適量光學樹脂膠，蓋上蓋玻片，寫好標簽。（6）觀察與計數

先用低倍鏡，后用高倍鏡粗略檢查，選擇細胞分布均勻，細胞無損，著色適當的區域，再在油浸鏡下計數。雖然不計數含微核的有核細胞（主要為幼紅細胞），但需用形態和染色完好的有核細胞來做判斷制片優劣的標準。

選擇細胞完整、分散均勻，著色適當的區域，在油鏡下觀察；以有核細胞形態完好作為判斷制片優劣的標準，計數1000個嗜多染紅細胞中有微核的細胞數。

本法系觀察嗜多染紅細胞的微核。用Giemsa染色法，嗜多染紅細胞呈藍灰色，成熟紅細胞呈粉紅或橘紅色。典型的微核多為單個的、圓形、邊緣光滑整齊，嗜色性與核質一致，呈紫紅色或藍紫色，直徑通常為紅細胞的1/20～1/5。也有兩個及多個微核的細胞。微核率每只動物計數1000個嗜多染紅細胞（也可以4個同學為一個小組，每位同學計數250個細胞），最后合并計算嗜多染紅細胞數中含有微核的細胞數。微核率一般以“千分率”（‰）表示。

數據處理

利用統計學軟件SPSS的單因素方差分析或t檢驗等方法，進行數據處理，分析實驗結果（如下表）。

組別劑量動物數受檢細胞數含微核細胞數微核率P值(g/kg體重)(只)(個)(個)(‰)受試物

溶劑對照

陽性物對照(mg/kg體重)

例表：對苯二酚對動物骨髓嗜多染紅細胞的微核發生率組別劑量動物數受檢細胞數含微核細胞數微核率P值

(g/kg體重)(只)(個)(個)(‰)受試物120

對苯二酚8040溶劑對照（蒸餾水）陽性對照環磷酰胺

(mg/kg體重)50實驗報告為設計性綜合性報告（交打印稿），內容包括：（1）受試物名稱、配制方法、所用溶劑；（2）

動物種屬和品系、體重、數量、性別、來源；（3）劑量分組，染毒途徑和方式；（4）試驗方法：簡述操作步驟，所用統計學方法，結果判定標準；（5）結果：以列表方式報告受試物對動物骨髓細胞微核發生率；（6）結論。要求參閱的文獻：

[1]孟紫強，阮愛東，桑楠等.SO2污染對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核的誘發作用.環境科學，2002，23（4）123-125.[2]孟紫強，桑楠，張波等.二氧化硫體內衍生物誘發小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核的效應.環境科學學報，2000，20（2