誘變物質(zhì)的微核試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)十一、十二實(shí)驗(yàn)原理

微核（Micronucleus，MN）：當(dāng)染色體受到損傷后，染色單體或染色體的無著絲粒斷片，或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細(xì)胞分裂后期，仍然游離在細(xì)胞質(zhì)中。末期之后，單獨(dú)形成一個或幾個規(guī)則的次核，被包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱為微核。微核試驗(yàn)（Micronucleustest，MNT）

：凡能使染色體發(fā)生斷裂或使染色體和紡錘體聯(lián)結(jié)有損傷的化學(xué)物，都可用微核試驗(yàn)來檢測。各種類型的骨髓細(xì)胞都可形成微核，但有核細(xì)胞的胞質(zhì)少，微核與正常核葉及核的突起物難以鑒別。所以多用無主核的細(xì)胞來進(jìn)行微核試驗(yàn)。嗜多染紅細(xì)胞（polychromaticerythrocyte，PCE）：是分裂后期，處于幼年紅細(xì)胞向成熟紅細(xì)胞發(fā)展中間階段的一群紅細(xì)胞。此時的紅細(xì)胞主核已排出，但因胞質(zhì)內(nèi)含有核糖體，用姬姆薩染色呈灰藍(lán)色；成熟紅細(xì)胞的核糖體已消失，則被染成橘紅色；而幼紅細(xì)胞則有較大的核，且被染成紫紅色。骨髓中嗜多染紅細(xì)胞數(shù)量充足，微核被染成紫紅色或藍(lán)紫色，很容易辨認(rèn)，而且微核自發(fā)率低。因此，骨髓中嗜多染紅細(xì)胞成為微核試驗(yàn)的首選細(xì)胞群。成熟紅細(xì)胞嗜多染紅細(xì)胞幼紅細(xì)胞嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解微核發(fā)生的機(jī)制；2、掌握微核實(shí)驗(yàn)的一般程序和實(shí)踐意義；3、掌握對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行藥物處理的一般程序、方法和注意事項(xiàng)；4、掌握進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一般程序和規(guī)則，學(xué)會用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并鍛煉實(shí)踐能力。儀器和器械

離心機(jī)、生物顯微鏡、解剖剪刀、鑷子、注射器、尖底刻度離心管、載玻片、蓋玻片、塑料吸瓶、吸水紙等。試劑及配制

（1）小牛血清（滅活）

將濾菌的小牛血清置于56℃恒溫水浴保溫30min滅活。滅活的小牛血清通常保存于冰箱冷凍室里。

（2）姬姆薩（Giemsa）染液（原液）

成分：Giemsa染料3.8g、甲醇 375mL、甘油125mL。

配制：將染料和少量甲醇于乳缽里仔細(xì)研磨，再加入甲醇至375mL和125mL甘油，混合均勻，放置37℃恒溫箱中保溫48h。保溫期間，振搖數(shù)次，促使染料充分溶解，取出后過濾，兩周后使用。（3）0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）成分：磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）71.64g/L（A液）

磷酸二氫鈉（NaH2PO4

·2H2O）31.21g/L（B液）分別加蒸餾水1000mL配成A、B液；取A液51ml,B液49ml混合，再加入100ml蒸餾水混勻，即為pH6.8的0.1mol/L磷酸緩沖液。（4）Giemsa應(yīng)用液取2mlGiemsa染液原液與40ml0.1mol/L磷酸鹽緩沖液混合而成。臨用現(xiàn)配。實(shí)驗(yàn)動物：

小鼠是微核試驗(yàn)的常規(guī)動物。體重一般為25g~35g（也可選用成年大鼠，體重為150g~200g）。正常小鼠嗜多染紅細(xì)胞自發(fā)微核頻率為2.6‰，陽性物（一般用環(huán)磷酰胺150mg/kg體重劑量）對照組微核頻率為30.4‰。（斑馬魚微核頻率范圍為0.25‰

~1.2‰

）劑量分組：

每種受試藥物一般至少設(shè)3個劑量。每個劑量組5-10只動物。另外，還應(yīng)設(shè)溶劑對照（陰性對照）和陽性物對照組。常用環(huán)磷酰胺作為陽性物對照，劑量可為40mg//kg體重（或150mg/kg體重）。如用斑馬魚（體重約0.5g，體長2.8~3.0cm

）測試水體污染物誘導(dǎo)微核的實(shí)驗(yàn)，則陽性對照物為氟化鈉（NaF），劑量為30mg/kg。一般為腹腔或腹部皮下注射。受試物：秋水仙素，對苯二酚，氯化汞（以往實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)）受試物劑量mg/Kg組別各受試小鼠1000個受檢細(xì)胞中含微核細(xì)胞數(shù)1234567對苯二酚1201802403秋水仙素1015213氯化汞312213陰性對照蒸餾水陽性對照環(huán)磷酰胺(40mg/kg)受試物：秋水仙素，對苯二酚，氯化汞（本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)）受試物(濃度)劑量mg/30g/只組別各受試小鼠1000個受檢細(xì)胞中含微核細(xì)胞數(shù)1234567對苯二酚(1.2mg/ml)240(0.2ml)1480(0.4ml)2720(0.6ml)3秋水仙素(0.1mg/ml)20(0.2ml)440(0.4ml)560(0.6ml)6氯化汞(0.03mg/ml)6(0.2ml)112(0.4ml)218(0.6ml)3陰性對照蒸餾水0(0.2ml)7陽性對照(200mg/ml)環(huán)磷酰胺40(0.2ml)8染毒途徑和方式

染毒途徑視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ǎＳ酶骨蛔⑸洌?4小時取材。

試驗(yàn)方法（1）骨髓的制取

①用斷頸法處死小鼠。用剪刀剪開腿部的皮膚，用鑷子夾住小鼠的股骨，剪去股骨周圍的肌肉，將小鼠的兩股骨取出(注意股骨的完整性)，擦凈股骨上的肌肉。去股骨的髖面，將吸有0.85%Nacl生理等滲液小注射器的針頭插入，反復(fù)數(shù)次吹出骨髓細(xì)(注意吹干凈)。反復(fù)吹打使其混合均勻，制成細(xì)胞懸液。

②將細(xì)胞懸液在1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄除上清液。（2）涂片在離心管中加入少量滅活的小牛血清（約0.3ml)混勻后，按血常規(guī)涂片法涂片，長度約2cm~3cm(涂片時一次涂成）。在空氣中晾干。（3）固定

將干燥的涂片放入無水甲醇液（或甲醇：冰乙酸=3:1的固定液）中固定5~10

min。即使當(dāng)日不染色，也應(yīng)固定后于冰箱中保存。（4）染色

將固定過的涂片放入Giemsa應(yīng)用液中，染色20min~30min，然后立即用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗。（5）封片

用濾紙及時擦干染片背面的水滴，再用雙層濾紙輕輕按壓染片，以吸附染片上殘留的水分，再在空氣中晃動數(shù)次，以促其盡快晾干，然后放入二甲苯中透明5min，取出滴上適量光學(xué)樹脂膠，蓋上蓋玻片，寫好標(biāo)簽。（6）觀察與計(jì)數(shù)

先用低倍鏡，后用高倍鏡粗略檢查，選擇細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞無損，著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域，再在油浸鏡下計(jì)數(shù)。雖然不計(jì)數(shù)含微核的有核細(xì)胞（主要為幼紅細(xì)胞），但需用形態(tài)和染色完好的有核細(xì)胞來做判斷制片優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)。

選擇細(xì)胞完整、分散均勻，著色適當(dāng)?shù)膮^(qū)域，在油鏡下觀察；以有核細(xì)胞形態(tài)完好作為判斷制片優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)數(shù)1000個嗜多染紅細(xì)胞中有微核的細(xì)胞數(shù)。

本法系觀察嗜多染紅細(xì)胞的微核。用Giemsa染色法，嗜多染紅細(xì)胞呈藍(lán)灰色，成熟紅細(xì)胞呈粉紅或橘紅色。典型的微核多為單個的、圓形、邊緣光滑整齊，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色，直徑通常為紅細(xì)胞的1/20～1/5。也有兩個及多個微核的細(xì)胞。微核率每只動物計(jì)數(shù)1000個嗜多染紅細(xì)胞（也可以4個同學(xué)為一個小組，每位同學(xué)計(jì)數(shù)250個細(xì)胞），最后合并計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞數(shù)中含有微核的細(xì)胞數(shù)。微核率一般以“千分率”（‰）表示。

數(shù)據(jù)處理

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS的單因素方差分析或t檢驗(yàn)等方法，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如下表）。

組別劑量動物數(shù)受檢細(xì)胞數(shù)含微核細(xì)胞數(shù)微核率P值(g/kg體重)(只)(個)(個)(‰)受試物

溶劑對照

陽性物對照(mg/kg體重)

例表：對苯二酚對動物骨髓嗜多染紅細(xì)胞的微核發(fā)生率組別劑量動物數(shù)受檢細(xì)胞數(shù)含微核細(xì)胞數(shù)微核率P值

(g/kg體重)(只)(個)(個)(‰)受試物120

對苯二酚8040溶劑對照（蒸餾水）陽性對照環(huán)磷酰胺

(mg/kg體重)50實(shí)驗(yàn)報(bào)告為設(shè)計(jì)性綜合性報(bào)告（交打印稿），內(nèi)容包括：（1）受試物名稱、配制方法、所用溶劑；（2）

動物種屬和品系、體重、數(shù)量、性別、來源；（3）劑量分組，染毒途徑和方式；（4）試驗(yàn)方法：簡述操作步驟，所用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)；（5）結(jié)果：以列表方式報(bào)告受試物對動物骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率；（6）結(jié)論。要求參閱的文獻(xiàn)：

[1]孟紫強(qiáng)，阮愛東，桑楠等.SO2污染對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的誘發(fā)作用.環(huán)境科學(xué)，2002，23（4）123-125.[2]孟紫強(qiáng)，桑楠，張波等.二氧化硫體內(nèi)衍生物誘發(fā)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的效應(yīng).環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2000，20（2