專題1

基因工程基因工程是指按照

，進行嚴格的設計，并通過

DNA重組和轉基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性，從而創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。由于基因工程是在

水平上進行設計和施工的，因此又叫做

。一、基因工程的概念人們的意愿體外DNA重組技術DNA分子操作環境操作對象操作水平結果生物體外基因DNA分子水平定向改造生物遺傳特性實質或原理：基因重組基因工程的特點：二、基因操作的工具1、基因的剪刀——限制性內切酶2、基因的針線——DNA連接酶3、基因的運輸工具——運載體1.2.1限制性核酸內切酶1.來源：主要是從

中分離純化出來的。2.功能：能夠識別雙鏈DNA分子的某種

核苷酸序列，并且使每一條鏈中

部位的兩個核苷酸之間的

斷開，因此具有

性。特定原核生物特定磷酸二酯鍵特異現在已知的核酸限制性內切酶均不能切割RNA3.識別序列：

長度：大多數限制酶的識別序列由

個核苷酸組成。也有4、5或8個核苷酸的。

結構特點：具有雙重旋轉對稱結構，即：回文結構。6

經限制酶切割產生的DNA片段末端通常有兩種形式：

和

。前者是限制酶在它識別序列的

將DNA的兩條鏈切開產生的，后者是限制酶在它識別序列的

切開產生的。黏性末端平末端中心軸線兩側中心軸線GAATTCGCTTAAAATTCG限制酶切割DNA分子示意圖CTTAAG黏性末端EcoRⅠ1.不同DNA分子用同一種限制酶切割形成的黏性末端都相同；2.同一個DNA分子用不同限制酶切割，產生的黏性末端一般不相同；3.不同限制酶切割形成的黏性末端，如互補則可以相互重新配對。1。分類：一類是從

中分離得到的，稱為

連接酶；另一類是從

中分離出來的，稱為

連接酶。1.2.2基因的的針線——DNA連接酶大腸桿菌E.coliDNAT4噬菌體T4DNA2。兩種DNA連接酶的比較：（1）相同點：都縫合

鍵。（2）區別：E·coliDNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補的

之間連接起來；而T4DNA連接酶既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的

，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的

。但連接平末端的之間的效率較

。磷酸二酯黏性末端黏性末端平末端低（3）連接的部位：磷酸二酯鍵，不是氫鍵名稱作用應用DNA連接酶限制性核酸內切酶DNA聚合酶RNA聚合酶解旋酶逆轉錄酶連接兩個DNA片段識別并切割某種特定的脫氧核苷酸序列在脫氧核苷酸鏈上添加單個脫氧核苷酸在核苷酸鏈上添加單個核苷酸氫鍵斷裂以RNA為模板合成DNA基因工程DNA復制轉錄DNA復制逆轉錄、基因工程1.2.3基因的運輸工具——運載體作用：具備的條件種類：將外源基因送入受體細胞。能在宿主細胞內復制并穩定地保存具有多個限制酶切點具有某些標記基因質粒、噬菌體和動植物病毒。使用運載體的目的用它作為運載工具，將目的基因送到宿主細胞中去。質粒的特點

質粒上會存在某些標記基因，標記基因有什么用途？思考質粒：是一種

的、

、

，并具有

能力的

。裸露結構簡單獨立于細菌擬核之外自我復制雙鏈環狀DNA分子鑒別和篩選含有目的基因的細胞---TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG------ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC---————————————————————————————————————---AGGATCTTAAGAGAGCCATACTTAAGGTATG------TCCTAGAATTCTCTCGGTATGAATTCCATAC---——————---——————————————————---————————————判斷：下列二個DNA分子（片段），哪一個是目的基因，哪一個是運載體？三、基因操作的基本步驟1、獲取目的基因2、構建基因表達載體3、將目的基因導入受體細胞4、目的基因的檢測和鑒定目前被較廣泛提取使用的目的基因有：

蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。1.目的基因的概念：人們需要的特定基因。（一）目的基因的獲取:種類基因組文庫：cDNA文庫：含有一種生物的全部基因含有一種生物的部分基因（1）從基因文庫中獲取目的基因2.獲取目的基因的方法：怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？根據基因的有關信息：如基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉錄產物mRNA、基因的翻譯產物蛋白質等。①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制____________的核酸合成技術。③條件：____________________、_____________、___________、

__________________.

前提條件：_____________________________②原理：__________聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段DNA復制已知核苷酸序列的基因四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶（Taq酶）一段已知目的基因的核苷酸序列（2）利用PCR技術擴增目的基因④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環的次數）⑤結果：指數2n使目的基因的片段在短時間內成百萬倍地擴增PCR技術擴增過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成__

____

b、退火（55℃-60℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈（二）基因表達載體的構建——核心質粒DNA分子限制酶處理兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同一種一個切口兩個黏性末端

目的基因與運載體結合的結果可能有幾種情況？1、目的基因與目的基因結合；2、質粒與質粒結合；3、目的基因與質粒結合。×√×基因表達載體的組成：a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因篩選重組DNA編碼區非編碼區非編碼區(編碼區上游)(編碼區下游)啟動子終止子基因是RNA聚合酶的結合位點，起動并催化轉錄mRNA終止轉錄mRNA外顯子內含子（三）將目的基因導入受體細胞常用的受體細胞：動植物細胞、大腸桿菌、土壤農桿菌、枯草桿菌等。轉化——目的基因進入_________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程受體細胞穩定表達方法導入植物細胞導入動物細胞導入微生物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態細胞吸

收DNA分子農桿菌轉化法農桿菌：感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物無感染能力。過程：構建表達載體（重組Ti質粒）轉入農桿菌導入植物細胞目的基因插入植物細胞染色體DNA中培養再生成植株篩選出表現新性狀的植株1.將目的基因導入植物細胞之顯微注射技術2.將目的基因導入動物細胞之將含有目的基因的表達載體提純(濃度1-3%ug/mL)取卵顯微注射人工受精將受精卵移入子宮感受態細胞3、將目的基因導入微生物細胞：(A)常用的受體細胞：大腸桿菌(最廣泛)、枯草桿菌、土壤農桿菌(B)導入途徑：受體細胞(細菌)CaCl2處理細菌細胞壁通透性增加感受態細胞與重組質粒混合感受態細胞吸收重組質粒主要是借鑒細菌或病毒侵染細胞方法原因：繁殖快，單細胞，遺傳物質少。（-4℃）因為大腸桿菌等細菌的細胞壁成分主要是肽聚糖，因此一般要先用Ca2＋處理，以增加細菌細胞壁的通透性。思考：為什么要用Ca2＋處理細胞？（四）目的基因的檢測與鑒定分子水平檢測—①檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質DNA分子雜交DNA-RNA分子雜交抗原—抗體雜交個體生物水平檢測—接種在大腸桿菌中生產這種糖蛋白是不可能的。若要生產人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？三、基因工程的應用（一）植物基因工程技術的應用1、提高農作物的抗逆能力

（1）抗蟲轉基因植物抗蟲基因的種類：4種

Bt毒蛋白基因（抗蟲棉）、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、植物凝集素基因（2）抗病轉基因植物抗病轉基因植物所用的基因：①常用：病毒外殼蛋白基因和病毒的復制酶基因②抗真菌轉基因植物中有：幾丁質酶基因和抗毒素合成基因（3）其它抗逆轉基因植物①抗鹽堿、干旱的基因：調節細胞滲透壓的基因②抗凍蛋白基因③抗除草劑基因1、用于提高動物生長速度

（如：導入外源生長激素基因鯉魚）2、用于改善畜產品的品質

（如：將腸乳糖酶基因導入奶牛基因組，使乳糖的含量大大減低）3、用轉基因動物生產藥物

（如：轉入人的a-抗胰蛋白基因的綿羊）4、用轉基因動物作器官移植的供體

（如：改造豬的器官）（二）動物基因工程的應用轉基因動物的乳腺。1.就基因藥物而言，最理想的表達場所是哪里？[乳腺(房)生物反應器]2.什么是乳腺(房)生物反應器？以動物乳房作為生產藥物的反應器稱為乳房生物反應器4.簡述乳房生物反應器的操作過程？獲取目的基因（如血清白蛋白基因）構建基因表達載體顯微注入羊的受精卵中形成胚胎送入羊子宮中5.乳房生物反應器的操作過程與轉基因動物操作過程有何不同之處？并闡述原因？

要在編碼蛋白質的基因序列前加上乳腺組織中特異表達的啟動子構成表達載體。因為產品在奶中形成，需要乳腺組織中特異表達的啟動子。（基因的選擇性表達）（三）基因診斷和基因治療基因診斷：

也稱為DNA診斷或基因探針技術，即在DNA水平分析檢測某一基因，從而對特定的疾病進行診斷。探針制備：放射性同位素(如32P)、熒光分子等標記的DNA分子；原理：利用DNA分子雜交原理；

是指把健康的外源基因導入有基因缺陷的細胞中，達到治療疾病的目的。基因治療包括：1、體外基因治療2、體內基因治療基因治療：

蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造或制造一種新的蛋白質，以滿足人類對生產和生活的需求。1.概念：四、蛋白質工程2.基本原理：確定蛋白質的功能→蛋白質應有的高級結構→蛋白質應具備的折疊狀態→應有的氨基酸序列→