主講人：綠色熒光蛋白（GFP）的基因克隆、表達及粗提取目錄

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綠色熒光蛋白簡介

1.一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內的生物發光蛋白2.

GFP是由238個氨基酸所組成的單體蛋白,相對分子質量為27.0kMr3.1962年，下村修等分離純化了水母中發光蛋白水母素，并發現這種綠色的熒光蛋白。1974年，他們分離得到了這個蛋白目錄

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綠色熒光蛋白優點

①熒光強度高，穩定性高；②分子量小，易于融合，適用于多種轉化方式，對受體無毒害，安全可靠；③不需要反應底物與其他輔助因子，受藍光激發產生綠色熒光，尤其適用于體內的即時檢測；④不具有種屬依賴性，在多種原核和真核生物細胞中都表達；⑤通過替換一些特殊氨基酸，可以使之產生不同顏色的光，從而適應不同的研究需要。近年來廣泛用于基因的表達與調控、蛋白質的定位、轉移以及相互作用、信號傳遞、轉染與轉化，以及細胞的分離與純化等研究領域

1.儀器：恒溫培養箱，超凈臺，恒溫搖床，制冰機，臺式離心機，核酸電泳儀，小型混合器，冰箱，藍盾可見光透射儀，移液器、電泳槽、振蕩器、制冰機、凝膠成像儀，水浴鍋，高壓滅菌鍋、振蕩培養箱，手持式紫外燈2.試劑：BamHI；NotI(10U/μL)；T4ligase；LB培養基；溶液Ⅰ；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ；TE緩沖液；20×TBE；GeneFinder-溴酚藍上樣緩沖液；1×TBE緩沖液目錄

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研究思路目錄

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1.質粒DNA的分離與純化01質粒DNA的分離與純化02酶切及連接03大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化04GFP蛋白的誘導表達.05綠色熒光蛋白的粗提取步驟一步驟二步驟三步驟四步驟五

主要步驟1.1細菌的生長和質粒的擴增1.2堿提取法1.3質粒DNA的提純目錄

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1.質粒DNA的分離與純化

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2.酶切及連接雙酶切1質粒酶切產物的鑒定2回收酶切產物3連接4目錄

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2.1雙酶切目錄

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儀器與試劑研究思路研究方法預期結果參考文獻研究背景反應物（μL）pEGFP-N3pET-28a質粒1818BamHI22NotI2210×bufferK330.1%BSA緩沖液33

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2.4連接目錄

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研究現狀研究思路研究方法預期結果參考文獻研究背景反應物體積/μL回收純化的pET-28a質粒5gfp基因片段12T4連接酶1緩沖液（10×）2DNA連接酶能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵，這種酶需要在一條DNA鏈的3’-末端具有一個游離的羥基（-OH），和在另一條DNA鏈的5’-末端具有一個磷酸基團（-P）3.1感受態細胞的制備(CaCl2法)3.2轉化涂板目錄

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3.大腸桿菌感受態細胞的制備及轉化

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4.GFP蛋白的誘導表達1.IPTG（異丙基硫代β-L半乳糖苷）是一種常見的誘導基因表達的誘導劑，結構類似乳糖。2.GFP基因連接到pET-28a的多克隆位點（MCS），GFP基因的表達受其上游T7啟動子和操縱基因O位點以及結合到這些順式作用元件的蛋白因子的控制。紫外燈下的綠色熒光蛋白

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4.GFP蛋白的誘導表達3.LacI基因編碼調節蛋白，可以四聚體的形式結合到操縱基因O位點上，關閉GFP基因的表達4.IPTG可與四聚體調節蛋白結合，從而改變調節蛋白的構象，使調節蛋白不再與O位點結合。接著BL21編碼的T7RNA聚合酶結合到T7啟動子位點，從而啟動GFP基因的表達紫外燈下各組綠色熒光蛋白

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5.粗提取1.挑取鑒定正確的單菌落接入LB培養基2.擴大培養3.IPTG誘導表達4.將菌液進行離心，收集菌體5.洗滌菌體，超聲破碎，離心，取上清。訪談結果與析

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預期結果

提取質粒加入溶液Ⅰ渾濁；加入溶液Ⅱ變澄清加入溶液Ⅲ出現白色絮狀沉淀加入氯仿抽提溶液分層訪談結果與析

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預期結果酶切產物鑒定——GFP基因訪談結果與析

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預期結果

重組質粒的鑒定訪談結果與析

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預期結果

重組質粒轉化涂板陰性對照陽性對照訪談結果與析

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預期結果綠色熒光蛋白菌落參考文獻：[1]ShimomuraO,JohnsonFH,SaigaY.Extraction,purificationandpropertiesofaequorin,abioluminescentproteinfromtheluminoushydromedusan,Aequorea[J].JCellComoPhysiok,1962,59:223-239.[2]KainSR,AdamsM,KondepudiA,etal.Greenfluorescentproteinasareporterofgeneexpressionandproteinlocalization.biotechniques,1995,19(4):650[3]PhillipsGJ.Greenfluorescentprotein-abrightideaforthestudyofbacterialproteinlocalization.FEMSmicrobialLett,2001,204(1):9[4]ChalfieM,Tu,EKivchenG,etal.Greenfluorescentproteinasamarkerforgeneexpression.Science,1994,263(5148):802[5]ChalfieM.Greenfluorescentprotein.PhotochemPhotobiol,1995,62(4):651[6]LarrickJW,BalintRF,YouvanDC.Greenfluorescentprotein:untappedpotentialinimmunotechnology.Immunotechnology,1995,1(2):83參考文獻：[7]薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆實驗指南[M].金冬雁，黎孟楓，譯.2版.北京：科學出版，1995.[8]杜禎,馬海利,陳瑞芳.工程菌DH-5α感受態細胞的制備及質粒pGEM的轉化研究中國畜牧獸醫,2007年第34卷第5期[9]NucP.NucK.RecombinantproteinproductioninEscherichiacoli[J].PostepyBiochem,2006,52(4):448-456.[10]DongX,TangB,LiJ,etal.ExpressionandPurificationofIntactandFunctionalSoybean(Glycinemax)SeedFerr