第三章

細胞培養的基本技術體外培養細胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養成功或失敗的首要條件。即便使用設備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，技術操作不規范,也會導致污染。為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠。基本操作技術和要求培養室的無菌操作：培養前準備：培養室和超凈臺的消毒：洗手和著裝：無菌培養操作：

培養前準備

在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關數據的計算要事先做好。根據實驗要求，準備各種所需器材和物品放置操作場所(培養室、超凈臺)內消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。基本操作技術和要求培養室和超凈臺的消毒

無菌培養室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min.

超凈工作臺臺面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。—些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內同時紫外線消毒。洗手和著裝

原則上和外科手術相同。開始操作前要用75％酒精消毒手和前臂。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養室都要重新用消毒液洗手。進行原代培養室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。

培養過程中的無菌操作

在無菌環境進行培養或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經過燒灼進行。

進行培養時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。

第一節

培養細胞的取材與分離一、培養細胞的取材：1、原代取材的基本要求：無菌取材取材器械要鋒利及時培養剔除與培養細胞無關的成分營養要豐富采用易培養的組織進行培養注意保存原代組織的相關材料及信息2、取材的基本器材和用品眼科組織彎剪、彎鑷、手術刀裝有無血清培養基或Hank’s液的小瓶小燒杯、培養皿3、不同組織的取材①皮膚和粘膜的取材取材目的：獲取上皮細胞（主），成纖維細胞取材方法：手術過程切除的部分組織；如有特殊需要可單獨取材（2～3mm2）注意事項：嚴格消毒；不用碘酒消毒；要獲取上皮細胞，取材時不要切取太厚，如欲培養成纖維細胞則反之。②內臟和實體瘤的取材取材目的：獲取各臟器細胞及瘤細胞取材方法：明確和熟悉所需的組織類型和部位，去除不需要的部分如血管、神經和結締組織；盡可能取腫瘤細胞分布較多的部分，避開壞死液化部分。注意事項：③血細胞的取材取材目的：白細胞----用于染色體分析、淋巴細胞體外激活進行免疫治療等。取材方法：靜脈取血（微量時，指尖或耳垂）注意事項：加入肝素抗凝（量適宜，過大導致溶血）抽血要嚴格無菌。④鼠胚組織的取材取材目的：取材方便，易于培養，與人類相近，是較常用的培養材料。取材方法：斷頸處死，75%酒精消毒5min，固定，解剖取材注意事項：保證無菌消毒浸入75%酒精時間不能太長，以免酒精入口消毒后的操作應在超凈臺或無菌環境中進行⑤雞胚組織取材取材目的：用于分離培養禽類病毒以進行疫苗的生產取材方法：選用9～12d的雞胚，無菌條件下剪開氣室端蛋殼，切開蛋膜，用小鑷子挑起雞胚，放到無菌培養皿中取材。注意事項：在無菌條件下操作。二、組織材料的分離目前分散組織的方法有機械法和化學法兩種。1、細胞懸液的分離方法：培養材料為血液、羊水、胸水和腹水等細胞懸液時，500～1000r/min低速離心5～10min。2、組織塊的分離方法：機械分散法：對一些纖維成分很少的組織，如腦組織、部分胚胎組織以及一些腫瘤組織。剪切分離法：組織塊移植培養。消化分離法：獲得細胞懸液直接培養。①機械分散法的步驟：先用Hank’s液或無血清培養液漂洗組織，剪成5～10mm3的小塊，置80目孔徑的篩網，用注射器針芯輕壓組織，使之壓碎并通過紗網。吸管吸出組織懸液，置150目篩中，步驟同上。鏡檢計數，接種。（組織過大，用400目篩）。②剪切分離法的步驟：沖洗的組織塊放在小燒杯中，用眼科剪反復剪至糊狀。加入Hank’s液或無血清培養液，反復輕輕吹打。低速離心去上清液，剩下組織小塊即可培養。③消化分離法消化法是結合生化和化學手段把已剪切成較小體積的組織進一步分散的方法。消化后組織松散、細胞分開，細胞容易生長，成活率高。常用的方法：胰蛋白酶消化法膠原酶消化法A、胰蛋白酶消化法：細胞間質少的軟組織組織剪成1～2mm3的小塊或糊狀，吸到三角燒瓶或培養瓶，加入預溫到37℃的胰蛋白酶。（也可在4℃冰箱中冷消化12～24h），放入37℃水浴或溫箱中20～60min。消化好后用Hanks液漂洗，去除胰蛋白酶，用培養液重懸細胞，計數、接種。B、膠原酶消化法：將漂洗修剪干凈的組織剪成1～2mm3的小塊，放到三角燒瓶，加入3～5倍體積的膠原酶，密封燒瓶，放入37℃水浴或溫箱（恒溫振蕩水浴箱）中4～48h，收集消化液，1000r/min離心5min，棄上清液，用培養液重懸細胞，計數、接種。第二節

原代培養技術原代培養概念：是從供體取得組織細胞后在體內進行的首次培養。原代培養是建立各種細胞系的第一步，是培養工作人員應熟悉和掌握的最基本的技術。原代培養的細胞生物學特性未發生很大變化，適合做藥物測試、細胞分化等實驗研究。原代培養的方法：組織塊培養法消化培養法一、組織塊培養法概念：是將組織剪切成小塊后，接種于培養瓶進行培養。（組織量少的原代培養）特點：簡便易行，成功率較高。操作：取材修剪沖洗剪切成1mm3小塊；移入培養瓶；分布組織小塊間距5mm；翻轉培養瓶并加培養液37℃靜置2～4h；翻正培養瓶進行培養；觀察原代細胞生長。二、消化培養法概念：組織通過消化分散法制成細胞懸液，接種、培養。（適合培養大量組織）優點：較短時間可獲得大量活細胞。缺點：步驟多，易污染，成本高。操作：按消化分離法獲取細胞；鏡下觀察見組織已分散，終止消化；200目篩網濾過組織塊；收集的消化液800～1000r/min離心5min；去上清，加含血清培養基制成細胞懸液；計數，接種于培養瓶。.動物細胞培養過程第三節

細胞傳代培養技術一、原代培養的首次傳代傳代：細胞由原培養瓶內分離稀釋后傳到新的培養瓶的過程，稱為傳代。注意：首次傳代非常重要。細胞生長到足以覆蓋瓶底大部分表面后再傳代。傳代時不同的細胞有不同的消化時間，注意觀察，及時處理。首次傳代時細胞接種數量要多；隨消化分離而脫落的組織塊也一并傳入新的培養瓶。二、細胞傳代方法傳代方法：貼壁細胞：消化傳代法。半懸浮生長細胞：吹打傳代。懸浮細胞：直接吹打或離心沉淀后再分離傳代。二、細胞傳代方法貼壁細胞傳代步驟：吸棄或倒掉瓶內陳舊培養基；加適量消化液，輕晃培養瓶，是消化液流遍所有細胞表面；消化2～5min，鏡下觀察見細胞質回縮、細胞間隙增大，終止消化；加少許含血清培養基，用吸管吹打；計數，接種到新的培養瓶。二、細胞傳代方法懸浮細胞傳代步驟：直接傳代：細胞沉淀、吸掉多半上清液、吹打、傳代。離心傳代：（常用此法）細胞及培養液吸到離心管內；800～1000r/min離心5min，棄上清液；加新的培養基，吸管吹打，然后傳代接種。半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）此類細胞部分呈現貼壁生長現象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。三、細胞系的維持細胞系的維持：就是通過換液、傳代、再換液、再傳代和細胞凍存來實現。注意：做好細胞系的檔案記錄工作；遵從細胞生長的規律；多種細胞系維持傳代，要嚴格操作程序，防止細胞間交叉污染；及時凍存。四、培養細胞的純化細胞的純化方法：自然純化和人工純化。自然純化：利用某一種類細胞的增殖優勢，而排擠其他細胞生長，靠自然的增殖潛力最后留下生長優勢細胞，去除其他細胞，達到細胞純化。不能人為選擇細胞。三、培養細胞的純化細胞的純化方法：人工純化：利用人為手段造成對某一種細胞生長有利的環境條件，抑制其他細胞的生長，從而達到細胞純化。方法有酶消化法、機械刮除法、反復貼壁法、克隆法、培養基限定法、流式細胞儀分離法。第四節

細胞凍存、復蘇和運輸技術一、細胞的凍存凍存的意義：節省人力和物力、維持原代細胞的特性。在制備單克隆抗體時，為保證雜交瘤細胞不致因傳代污染或因變異而丟失，應及時凍存。購買的細胞株，經過1～2次穩定傳代，及時凍存。凍存的原理：低溫冷凍（-196℃）為最大限度的保存細胞活力，細胞凍存及復蘇基本原則是慢凍快融。當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。如果冷凍速度過快，形成的結晶就大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。而緩慢冷凍可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶低溫保護劑的應用在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。使用濃度范圍在5～15%之間。細胞凍存步驟：取生長狀態好的細胞消化制成細胞懸液離心洗滌加含有10%DMSO凍存液混勻，移到凍存管（或安瓿）封口，做好標記，4℃40～60min，-20℃20～40min，

-70℃過夜第二天放在液氮管，記錄。二、細胞的復蘇細胞復蘇應采用快速融化：快速融化使細胞順利通過最易受損的-5～0℃，保證細胞外結晶在短時間內融化，避免緩慢融化時水分滲入細胞內再結晶，對細胞造成損害。復蘇失敗的原因：凍存細胞數量少或生長狀態差細胞污染液氮不足復蘇時，培養條件改變復蘇方法不當二、細胞的復蘇細胞復蘇步驟：從液氮罐取出細胞，迅速放到37℃水浴中。融化后，取出凍存管，消毒開蓋液體移到離心管，添加培養液，1000r/min離心5min除去上清液，用培養液稀釋，計數、接種。三、細胞的運輸細胞運輸的方法：冷凍儲存運輸：液氮凍存運輸：充液法：長距離運輸（幾天）：選擇生長好的細胞，充滿液體，封口，棉花包裹，到達目的地，吸去多余液體。短距離運輸（幾小時）：細胞懸液空運：第五節

培養細胞的觀察和檢測技術一、培養細胞的常規觀察1、培養液：直接用肉眼觀察培養液的顏色和透明度的變化。清亮透明，如出現混濁多為污染（懸浮細胞培養除外）。顏色變化：桃紅色，變黃表明代謝物增多，需要換液或傳代處理。培養液很快變黃：可能原因有細菌污染、培養器皿沒洗干凈，有殘留物、細胞接種密度較大。2、細胞生長情況：倒置顯微鏡觀察，細胞均需要經過一段適應期或潛伏期（時間長短不同）才增殖。原代培養最先見從組織邊緣“長出”細胞傳代的細胞潛伏期短，開始生長后很快進入指數生長期，長滿瓶底的80%，及時傳代。3、細胞形態變化：鏡下觀察到細胞透明度大、折光性強、輪廓不清，表明細胞生長狀態良好。用相差顯微鏡觀察細胞的細微結構。觀察到細胞折光性變弱，輪廓增強，胞質中出現空泡、脂滴、顆粒樣物質細胞間隙增大，變得不規則，表明細胞生長狀態不良。如果觀察到細胞從瓶壁脫落、崩解、漂浮，表明細胞生長狀態很差，要查明原因，采取措施。4、微生物污染：微生物污染包括細菌、霉菌、酵母菌、支原體等。細菌、霉菌、酵母菌污染最典型的表現為培養液渾濁，液體內漂浮菌絲或細菌。傳代穩定、生長規律的細胞系，如果培養條件不變而細胞生長明顯緩慢、胞質內顆粒增多，但培養基多不發生渾濁，考慮支原體污染。污染多發生在傳代、換液和加藥等操作之后。在這些操作之后的24～48h密切注意有無污染。二、細胞生長狀況的觀察1、細胞計數：細胞計數是細胞培養研究中的一項基本技術。血球計數板計數法和電子細胞計數儀計數法。步驟：準備計數板：95%酒精消毒，拭干制備細胞懸液加樣計數：10×物鏡、四角大方格中細胞計算：細胞數/毫升數=（四大格細胞數之和/4）×1041、細胞計數：細胞密度換算：c1×v1=c2×v2配制10ml106個細胞/ml細胞懸液，現有108個細胞/ml的細胞懸液，如何稀釋？

108×v1=106×10mlv1=0.1ml

吸取0.1ml108個細胞/ml的細胞懸液，補加9.9ml培養基即可。注意事項：取樣計數前充分混勻計數時，如見2個以上細胞組成的細胞團，記為一個，細胞團占10%以上，說明消化不充分四大格的數目相差8個以上，表示細胞分布不均。2、細胞生長曲線：測定細胞生長曲線是觀察細胞生長基本規律的重要方法。在細胞系細胞和非建系細胞的生長特性觀察中，其為最基本的指標。方法：取生長狀態良好的細胞，消化，計數，調整密度接種細胞于培養瓶（30個）或24孔培養板（2塊）每天取3瓶（孔）細胞消化，計數，計算平均值，10d培養時間為橫軸，細胞數為縱軸，匯出曲線。2、細胞生長曲線：結果分析：標準的細胞生長曲線近似“S”形。細胞倍增時間是在生長曲線上細胞數量增加1倍的時間。細胞群體倍增時間：作圖法和公式法

DT=t×lg2/lgnt-lgn0說明：接種細胞數不能過少也不能過多反映數值不夠精確，可有20～30%的誤差通過對生長曲線的繪制，了解細胞適合生長的培養基3、細胞分裂指數：分裂細胞占全部細胞的比例，用來表示細胞增殖旺盛程度。一般計算1000個細胞中的細胞分裂相數方法：消化，計數，調整密度接種到放置有小蓋玻片的培養瓶內每24h取出一個蓋玻片，按常規方法95%酒精固定，吉姆薩或HE染色、封片鏡下計數（細胞密度多、中、少三個區域）連續計數，可繪制細胞分裂指數曲線圖三、細胞培養的污染檢測和排除培養細胞的污染：包括微生物污染以及所有混入培養環境中的對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物污染。污染種類：微生物：真菌、細菌、病毒和支原體化學物質：細胞：非同一種細胞1、微生物污染：①污染途徑：空氣：最主要途徑。工作時減少空氣流動是防止污染的重要環節。器材：清洗消毒不徹底操作：無菌觀念不強，動作不準確，操作不規范等血清：生產時已污染組織樣本：原代培養的污染②污染對細胞影響：③污染檢測和排除：A、真菌污染和排除：種類很多：煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、酵母菌、白念珠菌肉眼見培養液形成白色或黃色漂浮物鏡下可見細胞之間有交錯的絲狀、管狀及樹枝狀的菌絲采用制霉菌素25μg/ml或酮康唑10μg/ml白色念珠菌污染B、細菌污染和排除：常見的污染菌有：大腸桿菌、白色葡萄球菌、假單胞菌等肉眼見培養液短期內顏色變黃，明顯渾濁鏡下可見培養液中有大量圓球形顆粒漂浮，必要時，可取少量培養液涂片染色檢查采用聯合抗生素細菌污染C、支原體污染和排除：支原體是一種大小介于細菌和病毒之間并獨立生活的微生物。無細胞壁，形態高度多形性，可為圓形、絲狀或梨形。支原體污染的檢測：相差顯微鏡：直接觀察和低滲溶脹處理地衣紅染色觀察熒光染色法：Hoechst33258電鏡觀察DNA分子雜交檢查或支原體培養支原體污染C、支原體污染和排除：支原體污染的排除：抗生素處理：四環素類、大環內酯類：高熱處理：41℃作用5～10h：巨噬細胞和抗生素聯合處理：鼠的傳代處理：血清處理：2、細胞交叉污染及排除：防止交叉污染的措施：①實驗器材如吸管不能混用②培養用液公用時，細胞吸管和細胞用液管要分開，以防將細胞帶到培養用液中。③實驗的細胞要及時凍存。3、化學物質污染及排除：化學污染物質包括：①殘存洗滌劑；②細胞殘余；③解體的微生物等。防止化學物質污染的措施：實驗所有器材都要嚴格清洗和滅菌消毒，并正確掌握器材操作要領。四、干細胞

干細胞（stemcell）是具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體，即這些細胞可通過分裂維持自身細胞的特性和大小，又可進一步分化為各種組織細胞，從而在組織修復等方面發揮積極作用。概念干細胞研究成為繼人類基因組大規模測序之后最具活力、最有影響和最有應用前景的生命學科研究領域。

1999年干細胞研究被美國《科學》雜志評為1999年度世界十大科學之冠，2000年干細胞研究再次被《科學》雜志評為該年度世界十大科學成就之一。

組織工程是以干細胞研究為基礎發展起來，它有望解決臨床上急需的人工組織與器官問題，進展極為迅速，已經成為干細胞應用的主要方向。（一）概述干細胞有幾個主要特征干細胞本身不是終末分化細胞；干細胞能無限增殖分裂；干細胞可連續分裂幾代，也可在較長時間內處于靜止狀態；干細胞分裂產生的子細胞只能有兩種命運——保持為干細胞或分化為特定細胞。干細胞的分類全能干細胞多能干細胞單能干細胞按分化潛能按發育狀態胚胎干細胞成體干細胞根據干細胞組織發生的名稱進行分類胎胎干細胞造血干細胞骨髓間質干細胞肌肉干細胞成骨干細胞內胚層干細胞視網膜干細胞胰腺干細胞全能干細胞：具有形成完整個體的分化潛能。如胚胎干細胞（ES細胞）。多能干細胞：具有分化出多種細胞組織的潛能。如造血干細胞、神經干細胞。單能干細胞：只能向一種或兩種密切相關的細胞類型分化。如上皮組織基底層的干細胞，肌肉中的成肌細胞。胚胎干細胞

ES細胞是一種高度未分化細胞。它具有發育的全能性，能分化出成體動物的所有組織和器官，包括生殖細胞。研究和利用ES細胞是當前生物工程領域的核心問題之一。在未來幾年，ES細胞移植和其它先進生物技術的聯合應用很可能在移植醫學領域引發革命性進步。成體干細胞

成年動物的許多組織和器官，比如表皮和造血系統，具有修復和再生的能力。成體干細胞在其中起著關鍵的作用。在特定條件下，成體干細胞或者產生新的干細胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能細胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態平衡。

1981年Evans和Kaufrnan及Martin首次由小鼠中分離得到鼠的胚胎干細胞。至今已分離得到的胚胎干細胞物種有：金黃地鼠（1988）、貂（1993）、豬（1994，1997）、雞（1996）、恒河猴（1995）、絨猴（1996）。