2012.09第二節噬菌體載體

2噬菌體載體（phagevectors）一、噬菌體載體二、單鏈噬菌體載體三、噬菌粒載體四、柯斯質粒載體一、噬菌體載體噬菌體是一類細菌病毒（Bacteriophage）（一）噬菌體的一般特性結構：蛋白質外殼內包裹著DNA（雙鏈、單鏈、線性、環狀等）。T4Bacteriophage71.噬菌體的生物學特性溶菌周期指噬菌體將DNA注入寄主細胞后很快環化，然后進行自我復制、蛋白衣殼合成和新噬菌體顆粒的組裝，最后使寄主細胞破裂而釋放出大量的子代噬菌體。溶源周期中，注入寄主細胞的噬菌體DNA是整合到寄主細胞染色體上并可以隨著寄主細胞的分裂而進行復制。整合了一套完整的噬菌體基因組的細菌被稱為溶源性細菌。在溶源性細菌內存在的整合或非整合的噬菌體DNA被稱為原噬菌體。噬菌體溫和噬菌體，具有溶源生長周期和溶菌生長周期烈性噬菌體,只具有溶菌生長周期分為兩種：（1）溶菌周期：噬菌體的生活周期烈性噬菌體（virulentphage)（2）溶原周期：感染細菌后，將自己的DNA整合到細菌的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶源化溫和噬菌體（temperatephage)2、噬菌體的的結構和和其核酸酸類型：結構：無尾部結結構的二二十面體體型、具尾部結結構的二二十面體體型、線狀體型型核酸類型型：最常常見的是是雙鏈線線性DNA、雙鏈環形形DNA、單鏈環形形DNA、單鏈線形形DNA、單鏈RNA。3、λ-DNA的物理理圖譜λ-DNA為線線狀雙鏈鏈DNA分子，，兩端各各有一個個12核核苷酸的的互補單單鏈（粘粘性末端端）GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA，稱稱為cos區，，全長48.5kb。。特點是功功能相近近的基因因在基因因組中聚聚集在一一起。λ噬菌體體組成特點點：雙鏈線狀狀DNA分子，，全長50kb，，含65個個基因，，在其分子子兩端各各含有12個堿堿基的互互補單鏈鏈，是天天然的粘粘性末端端，被稱稱為COS位點點。λ噬菌體體感染細細菌后的的溶菌性性生長和和溶源性性生長溶菌性生生長（lyticpathway）噬菌體感感染細菌菌后，借借助其2個COS位點點互補成成環，在在宿主菌菌體內連連續復制制，合成成大量基基因產物物，進而而裝配成成噬菌體體顆粒，，裂解宿宿主菌，，釋放出出來的噬噬菌體又又可感染染其他細細菌。溶源性生生長(lysogenicpathway)噬菌體感感染細菌菌后，可可將自身身DNA整合到到細菌的的染色體體中去，，與之一一起復制制，并遺遺傳給子子代細胞胞，宿主主細胞不不被裂解解。噬菌體AWBDEFZJattxisNclcroOPQSR結構區重組區調控區裂解區cos位位點cos位點ARAREcoRI目的基因因EcoRIEcoRI插入型置換型AWBCDEFZUVGHMLKIJb2cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS頭部基因因尾尾部基因因功功能不不明區溶源化重重組早早期期控制阻阻遏遏DNA合成溶溶菌生長非必必須區段段cI基因因：溶源源過程控控制基因因。λ噬菌體體的基因因組結構構5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’’3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’’CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephagecosendsCircularformLinearform（二）λλ噬菌體體載體的的主要類類型（1）插入式載載體一種只具具有一個個可供外外源DNA插入入的克隆隆位點的的派派生載載體。（2）替替換型型載體（（取代型型載體））具有成對對的克隆隆位點，，在這兩兩個位位點之間間的λDNA區段可可以被外外源插入入的DNA片段段所取代代。（3）凱凱倫倫噬菌體體載體（2）λλ替換換型載體體（取代代型載體體）外源DNA取代代噬菌體體染色體體中對于于噬菌體體的感染染和復制制非必要要的片段段(~20kb)高感染效效率(109轉化株/ug載載體DNA,比比質粒高高100-倍)e.g.EMBL3,DASH替換式載載體野生型噬噬菌體染染色體的的中段對對于噬菌菌體的感感染和復復制是非非必要的的，外源源DNA可以取取代這一一片段，，例如Charon4A、、λEMBL3/4、、Charon40等等載體，，這些載載體是用用Lac5（（乳糖操操縱子的的大部分分系列，，包括完完整的LacZ）替替換入噬噬菌體的的中間區區段，同同時將Lac5作為為選擇標標記，使使用時用用EcoRI水水解，去去掉中間間的片段段，再與與欲克隆隆片段在在體外進進行重組組、包裝裝。而后后，感染染E.coli使之在E.coli內繁殖，，并裂解解E.coli，形成空空斑。換型噬菌菌體λ是是使用最最廣泛的的載體。。（3）凱凱倫噬菌菌體載體體既有插入入型；又又有替換換型在基因工工程實驗驗中的用用途十分分廣泛承受外源源DNA的能力力：幾個個kb到到23kb（左右臂臂連接））（（三段段自身連連接）（（插入片片段）（三）體體外包裝裝λ噬菌體體DNA體外重重組后，，一般必必須經過過體外包包裝，然然后以噬噬菌體感感染的方方式將重重組DNA導入入E.coli細胞內。。這是因因為以感感染方式式導入細細胞的頻頻率可達達106~108/μgDNA，，而以轉轉染（translation）的的方式導導入的頻頻率僅為為103~105/μgDNA。λ噬菌體體的包裝裝限制為為野生噬噬菌體DNA（（約48.5kb））的75%~105%。由于λ噬菌體包裝時，當DNA的長度短于野生型的78%或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的ＤＮＡ，要求λ載體DNA和外源DNA長度之和在39～53kb之間。插入式載體可攜帶的外源ＤＮＡ片段較替換式為小。

◆λ噬噬菌體載載體可接接受15kb-23kb的外源源DNA片段，，它既可可作為克克隆載體體，也可可作為表表達載體體，廣泛泛用于各各類基因因庫的構構建。篩選標記記：藍白斑(LacZ)、噬菌斑等。重組噬菌菌體的分子量量必須在在野生型噬噬菌體分子量大大小的75%至105%之間。用途：b.用于構建建基因組組或cDNA文文庫。c.用于抗抗體庫庫或隨隨機肽肽庫的的構建建。a.用作一一般的的克隆隆載體體。（四））λλ-DNA的抽抽提大腸桿桿菌培培養至至對數數生長長期2)加加入入λ-噬菌菌體或或重組組λ-噬菌菌體懸懸浮液液，37℃℃培養養1hr3)用用新新鮮培培養稀稀釋，，繼續續培養養4-12hr4)高速離離心，沉淀噬噬菌體5)苯酚抽抽提，釋放λλ-DNA6)乙醇或或異丙醇沉淀淀DNA（五）λ-DNA作為載載體的優點體外包裝病毒毒顆粒，高效效感染E.coli2)裝載外外源能力為25kb，大大于質粒3)篩選方方便4)重組λλ-DNA分分子提取容易易二、、單鏈鏈噬噬菌菌體體載載體體（一一））單鏈鏈噬噬菌菌體體載載體體M13、f1、fd噬菌菌體體單鏈鏈環環狀狀DNA的絲絲狀狀大大腸腸桿桿菌菌噬噬菌菌體體：：M13噬菌菌體體單鏈鏈DNA噬噬菌菌體體載載體體M13、、f1、、fd。。優越越性性：：1.單單鏈鏈DNA噬噬菌菌體體的的復復制制，，是是以以雙雙鏈鏈環環形形的的DNA為為媒媒介介的的，，這這種種復復制制形形式式的的DNA簡簡稱稱RFDNA；；2.不不論論是是RFDNA還還是是ssDNA都都能能感感染染大大腸腸桿桿菌菌；；3.單單鏈鏈DNA噬噬菌菌體體顆顆粒粒的的大大小小，，是是受受其其DNA的的多多制制約約的的，，不不存存在在包包裝裝限限制制問問題題；；4.容容易易測測定定外外源源DNA片片斷斷的的插插入入取取向向；；5.可可產產生生含含外外源源片片斷斷的的單單鏈鏈DNA分分子子。。3.M13噬噬菌菌體體噬菌菌體體正鏈鏈復制制復制制型型DNA經pII蛋蛋白白造缺缺口口3′′5′′經pII蛋白白剪切切釋出出單單鏈鏈DNA(正鏈鏈)進入入下下一循循環環5′′3′′3′′5′′滾環環復復制制在細細菌菌內內的的復復制制模模式式圖圖M13噬噬菌菌體體幾幾個個重重要要特特點點：1.M13噬噬菌菌體體不溶溶解解宿主細胞胞，只是是降低宿主細胞胞的生長長速度。。2.M13噬菌體體能以單鏈和雙鏈兩種方式式存在，，因此可可以用感染(經包裝裝的單鏈鏈DNA)和轉化(雙鏈DNA)。3.克克隆的外外源基因因片段不不宜大于于1000bp。M13噬噬菌體載載體M13是一一種含單單鍵（+）DNA（ssDNA）的的絲狀大大腸桿菌菌噬菌體體，其基基因組大大小為6.4kb。這這類載體體主要用用來獲得得大量的的單鏈ＤＤＮＡ片片段，這這種單鏈鏈ＤＮＡＡ片段在在遺傳學學研究中中主要用用來測定定ＤＮＡＡ序列（（sanger雙脫氧氧法）、、基因的的定點突突變研究究、異源源雙鏈DNA的的分析等等。M13噬噬菌菌體體的的特特點點感染染Ecoli后，，在在宿宿主主細細胞胞內內會會形形成成雙雙鏈鏈的的復復制制型型ＤＤＮＮＡＡ（（replicationformDNA,RFDNA））。。可可以以象象質質粒粒ＤＤＮＮＡＡ那那樣樣在在體體外外進進行行純純化化和和操操作作。。成熟熟的的噬噬菌菌體體顆顆粒粒僅僅能能感感染染E.coli的F+細胞胞，，這這是是因因為為這這種種噬噬菌菌體體的的感感染染位位點點在在性性散散毛毛上上。。但但是是無無論論是是RFDNA或或ssDNA都都能能轉轉染染E.coli的F+或F-細胞胞。。噬菌菌體體顆顆粒粒的的大大小小是是受受其其ＤＤＮＮＡＡ的的大大小小制制約約的的，，這這一一點點正正好好與與λλ噬噬菌菌體體相相反反。。所所以以M13噬噬菌菌體體并并不不存存在在包包裝裝限限制制的的問問題題。。M13單單鏈鏈DNA噬噬菌菌體體的的生生命命周周期期RFDNAPhageM13replicationinthehostcell:+RNApolDNApolIII±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.（二）M13載體體的構建（1）克隆隆區域的選選定①基因間間隔區（intergenicregion,IG區））J.Messing證明，，IG區存存在M13的復制起點，但可以插插入外源DNA而不不影響M13噬菌體體的活力。。在IG區內內插入一個個大腸桿菌菌的LacZ’’（-肽序列)。利用-肽序列中中的三個單單一酶切位位點（BglII、AvaII和和PvuI））。(2)加入入酶切位點點①在IG區內加入入單一內切切酶位點第一個M13載體：：M13mp1：M13RFBsuI不完全消化化各種長度的的線性片斷斷（其中應有有只在IG上切開的的線性全長長M13））E.colilac基因的HindII片斷(lacI、lacP、lacO、lacZ’’）連接M13mp1JM101宿主只有在IG區插入lacZ’’才能存活并并在Xgal上出現互補補的藍噬菌菌斑（三）M13系列列載體的優優點1）有MCS，，便于克隆隆不同的酶酶切片段2）Xgal顯色反反應，可供供直接選擇擇3）無包裝裝限制，克克隆能力大大4）可以克克隆雙鏈DNA分子子中的每一一條鏈子代M13噬菌體中中包含的是是單鏈+DNA。（四）M13噬菌體體用途：1）DNA序列列測定；2）制制備單鏈DNA探針針；3）用用于定點突突變的研究究。M13載體體具有多克隆隆位點(MCS)，，方便克隆隆。許多M13載體體的多克隆隆位點與質質粒載體pUC序列列的多克隆隆位點是相相同的，在在克隆位點點選擇上更更為方便。。可以定向地地克隆DNA片段，，克隆在M13RFDNA分子上上的雙鏈DNA片段段，到了子子代噬菌體體便成了單單鏈的形式式。所以如如果要同時時分離ＤＮＮＡ分子中中的雙鏈，，則需要兩兩種獨立的的克隆。根根據M13的生物學學特性知道道，M13子代噬菌菌體中總是是只含有（（＋）鏈，，所以M13載體克克隆的外源源DNA片片段在子代代噬菌體中中究竟是含含有DNA分子中的的哪條鏈，，則完全取取決于外源源ＤＮＡ克克隆時的取取向。這樣樣一來，為為分別分離離外源ＤＮＮＡ分子的的兩條鏈帶帶來一定的的麻煩，解解決這一問問題的一個個行之有效效的方法就就是定向克克隆技術。。M13克隆載載體分子結構構圖三、噬菌粒載載體噬菌粒載體由質粒載體和和單鏈噬菌體體載體結合而而成的新型的的載體系列。。它具有質粒的的復制起點、、選擇性標記記、多克隆位位點等，方便便DNA的操操作，可在細細胞內穩定存存在；又具有有單鏈噬菌體體的復制起點點，在輔助噬噬菌體的存在在下，可進行行噬菌體的繁繁殖，產生單單鏈的子代噬噬菌體。噬菌粒載載體（phagemidvectors）由質粒載體體與單鏈噬菌菌體載體體的復制起起點結合合而成的的新型載載體系列列。MCS噬菌體ori質粒oriAmprlacZ’lacI約3000bp（比M13小小）②克隆能能力大能插入10kb的外源源DNA。③兩種復復制形式式①分子量量小1、噬菌菌粒載體體的特點點既具有質質粒的復復制起點點，又具具有噬菌菌體的復復制起點點。既能在大大腸桿菌菌中以質質粒的形形式雙鏈鏈復制，，又能在在噬菌體體內進行行單鏈復復制。常用的噬噬菌粒載載體pUC118和pUC1191.具具有較小小分子量量的共價價、閉合合、環形形的基因因組DNA，可可克隆10kb的外源源DNA片段，，并易于于進行分分離與操操作；2.編編碼一個個ampr基因作為為選擇記記號，因因此只有有攜帶pUC118或或pUC119噬菌粒粒載體的的大腸桿桿菌轉化化子細胞胞，才能能夠在含含有氨芐芐青霉素素的培養養基中生生長，便便于轉化化子的選選擇；3.拷拷貝數含含量高，，每個寄寄主可高高達500個，，所以只只要用少少量的大大腸桿菌菌細胞培培養物，，便可制制備出大大量的載載體DNA；4.存存在著一一個多克克隆位點點區，因因此許多多種不同同類型的的外源DNA片片段，不不經修飾飾便可直直接插入入到載體體分子上上；5.由由于多克克隆位點點區阻斷斷了大腸腸桿菌lacZ基因的的5’-端編碼碼區，可可按照IPTG組織化化學顯色色反應試試驗，篩篩選重組組子；6.lacZ基因是是置于lac啟啟動子的的控制之之下，這這樣插入入的外源源基因便便會以融融合蛋白白質的形形式表達達；7.含含有質粒粒的復制制起點，，在沒有有輔助噬噬菌體的的情況下下，克隆隆的外源源基因可可以像質質粒一樣樣按常規規的方式式，復制制形成大大量的雙雙鏈DNA分子子8.帶帶有一個個M13噬菌體體的復制制起點，，在有輔輔助噬菌菌體感染染的寄主主細胞中中，可以以合成出出單DNA拷貝貝，并包包裝成噬噬菌體顆顆分泌到到培養基基中；9.在在pUC118和pUC119這兩兩個載體體中，多多克隆位位點區的的核苷酸酸序列取取向是彼彼此相反反的，于于是它們們當中的的一個可可轉錄克克隆基因因的正鏈鏈DNA，另一一個則可可轉錄出出負鏈DNA；；10.可可以直直接對克克隆的DNA片片斷進行行核苷酸酸的序列列測定，，免去了了從質粒粒載體到到噬菌體體的這一一煩瑣的的亞克隆隆步驟。。pBluescript噬菌菌粒載體基本結構：：1.在多多克隆位點點的兩側，，有一對T3和T7噬菌體的的啟動子，，可以定向向指導外源源基因的轉轉錄活動；；2.同同時具有一一個單鏈噬噬菌體M13或f1的復制起起點和一個個來自ColE1質質粒的復制制起點，在在不同的情情況下，可可以采取不不同的復制制形式，分分別合成單單鏈或雙鏈鏈的DNA；3.編編碼有一個個胺芐青霉霉素抗性基基因，供作作轉化子記記號；4.含有lacZ基基因，可用用Xgal-IPTG組織顯顯色反應法法篩選噬菌菌粒載體。。T7T3用于體外轉轉錄3PCR產物物克隆載體體T載體體pCR系列列載體Invitrogen公司開開發的線性噬菌粒載體體。①結構pUC的質質粒部分、、fi噬菌菌體ori、Kanr和Ampr抗性。MCS的中中部已經切切開，各有有一個3’’端突出的的T。②特點PCR產物物往往在3’端突出出一個A，，所以能與與這個載體體直接連接接。Tvector的克隆過程程——簡便！AATTTvectorPCRproductT4DNAligaseAA四、柯斯質質粒載體柯斯質粒(cosmid)一種人工構構建的克隆隆載體，包包含了λ噬噬菌體的cos基因因。柯斯質質粒能被包包裝到λ噬噬菌體粒子子中，感染染大腸桿菌菌；它攜帶帶入宿主細細菌的DNA片段（（超過45kb）要要比質粒載載體攜帶的的要大（一）粘粒粒(cosmid)組成：2.抗抗性基因；；1.質質粒復制的的起始位點點(ORI)；3.用用于插入目目的基因的的單個酶切切位點；4.噬菌體的cos位點點。可見，cosmid是由質粒和和噬菌體的cos位點點構建而成。。與噬菌體載載體和質粒粒載體相比比具有多個個優點：（1）具有有cos位位點，能高高效地轉化化大腸桿菌菌，能在大大腸桿菌中中實現自身身環化，并并能在大腸腸桿菌中復復制；（2）有像像質粒一樣樣的選擇標標記；（3）cosmid載體比較較小，但能能插入較大大的外源片片段，可克克隆外源片片段的長度度在15~45kb之間。。由于cosmid載載體的大片片段克隆能能力，多用用于基因組組文庫的構構建，而λλ噬菌體載載體多用于于cDNA文庫的構構建。已有有多種粘粒粒載體可用用于基因克克隆，pJB8是最最常用的粘粘粒載體之之一（4)多多種單一酶酶切位點，，便于克隆隆1、粘粒載載體的優點點柯斯質粒載載體的特點點具有λ噬菌菌體的特性性；具有質粒載載體的特性性；具有較高容容量的克隆隆能力；具有與同源源性序列的的質粒進行行重組的能能力特點：可插入長達達27～41kb的外源基因因，方便地地用于克隆大片段段DNA。加入噬菌體頭部和尾部部蛋白，可可將粘粒包裝成成類似于噬菌體的具感染能能力的顆粒粒，方便地地進入大腸腸桿菌。粘粒進入細細菌后則完完全失去噬菌體的功能能，而而表現現質粒的特性性。柯斯質質粒載載體cosmid載載體：也稱稱粘粒粒、柯柯斯載載體。。這是是一類類用于于克隆隆大片片段DNA的載載體，，它是是由λλ噬菌菌體的的cos（（cohesive）末末端及及質粒粒（plasmid）重重組而而成的的載體體。cosmid載載體帶帶有質質粒的的復制制起點點、克克隆位位點、、選擇擇性標標記以以及λλ噬菌菌體用用于包包裝的的cos末末端等等，因因此該該載