會(huì)計(jì)學(xué)1ELISA基礎(chǔ)知識(shí)及常見問(wèn)題的處理ELISA檢測(cè)方法

夾心法:雙抗原（抗體）夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，其檢測(cè)方法：雙抗原夾心：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標(biāo)抗原Ag*→Ag-Ab-Ag*+底物(TMB)→顯色雙抗體夾心：固相(包被)抗體Ab+樣品(抗原Ag)+酶標(biāo)抗體Ab*→Ab-Ag-Ab*+底物(TMB)→顯色第1頁(yè)/共18頁(yè)間接法間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。其檢測(cè)方法：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標(biāo)二抗Ab*→Ag-Ab-抗Ab*+底物(TMB)→顯色第2頁(yè)/共18頁(yè)競(jìng)爭(zhēng)法其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標(biāo)抗體Ab*→Ag-Ab+底物(TMB)→不顯色(+)固相(包被)抗原Ag+樣品(無(wú)抗體Ab)+酶標(biāo)抗體Ab*→Ag-Ab*+底物(TMB)→顯色(-)第3頁(yè)/共18頁(yè)診斷試劑所用的質(zhì)量指標(biāo)及相互關(guān)系：

靈敏度：能檢測(cè)到的分析物的最小量，表示檢測(cè)下限的能力。相對(duì)靈敏度=真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陰性）×100%測(cè)定方法及表示方法：靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控血清、陽(yáng)性標(biāo)本稀釋終點(diǎn)、血清盤（pannel）及臨床標(biāo)本陽(yáng)性率。靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品可以從衛(wèi)生部臨檢中心購(gòu)買，質(zhì)控血清可以從衛(wèi)生部臨檢中心購(gòu)買，也可以自己配制。因?yàn)橘|(zhì)控血清不一定是原倍血清，或由于片段、亞型、位點(diǎn)等原因，評(píng)定試劑盒的靈敏度都帶有一定的片面性。陽(yáng)性標(biāo)本稀釋終點(diǎn)的方法常用于不同試劑盒的比較，但也有上述的片面性。陽(yáng)性pannel有些可以從衛(wèi)生部臨檢中心購(gòu)買，如HBsAg陽(yáng)性pannel，也可以自己配制。臨床標(biāo)本陽(yáng)性率，是一種粗略的估計(jì)，但對(duì)臨床很實(shí)用。第4頁(yè)/共18頁(yè)特異性：真陰性標(biāo)本的檢出能力。相對(duì)特異性=真陰性/（真陰性+假陽(yáng)性）×100%測(cè)定及表示方法：質(zhì)控血清、血清盤、臨床標(biāo)本陰性率。質(zhì)控血清、血清盤可以從衛(wèi)生部臨檢中心購(gòu)買，也可以自己配制。自己配制時(shí)注意陰性標(biāo)本的在血清盤中的比例以及代表性。臨床標(biāo)本陰性百分率是臨床使用中對(duì)試劑盒特異性的粗略的判斷。如果數(shù)批產(chǎn)品都通過(guò)了特異性參比測(cè)定，是否產(chǎn)品的特異性就一樣了呢？不一定。因?yàn)樘禺愋詤⒈绕返臄?shù)量不可能很大（樣本與整體的差異），引起非特異性的因素很多，目前尚不完全清楚。質(zhì)控血清盤也存在同樣的問(wèn)題。第5頁(yè)/共18頁(yè)有關(guān)名詞簡(jiǎn)介

質(zhì)控血清：質(zhì)控血清是為了對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行控制而配制的血清。質(zhì)控血清可以是定值也可以是不定值，可以購(gòu)置也可以自配。自己配制時(shí)要注意選用無(wú)脂血的血清或血漿，不能用試劑盒內(nèi)的陽(yáng)性對(duì)照。若用稀釋的血清作為質(zhì)控血清，應(yīng)考慮稀釋基質(zhì)成分對(duì)結(jié)果的影響。因質(zhì)控血清與臨床標(biāo)本不一致，應(yīng)該注意對(duì)結(jié)果的分析，應(yīng)該注意質(zhì)控血清只能用于質(zhì)控活動(dòng)，不可用于標(biāo)定儀器或評(píng)價(jià)方法。用于室內(nèi)質(zhì)控的質(zhì)控血清一般選取CUTOFF值2-3倍的質(zhì)控品。第6頁(yè)/共18頁(yè)室內(nèi)質(zhì)控：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部使用控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的一種質(zhì)量控制。室間質(zhì)評(píng)：用于考核各個(gè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果可靠性的一種考核，可分為國(guó)家級(jí)和地方級(jí)的室間質(zhì)評(píng)。可以理解為“各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量評(píng)比”。第7頁(yè)/共18頁(yè)臨界值（CUTOFF值）：臨界值是判斷陰陽(yáng)性或有臨床意義水平的數(shù)值，臨界值的確定是測(cè)定大量數(shù)據(jù)后應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定的。許多試劑都會(huì)給出臨界值或臨界值的計(jì)算方法。本底：就是底色。如ELISAHBsAg，陽(yáng)性顯色，陰性不顯色，本底就是整個(gè)陰性顯色的情況。ELISA抗–HBcAb，陽(yáng)性不顯色，陰性顯色，本底就是整個(gè)陽(yáng)性顯色的情況。第8頁(yè)/共18頁(yè)陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照：陰、陽(yáng)性對(duì)照若有正確的結(jié)果，對(duì)試劑盒操作的結(jié)果可以有粗略的判斷。空白對(duì)照：對(duì)ELISA試劑來(lái)說(shuō)，空白對(duì)照實(shí)際上是不加標(biāo)本不加酶做對(duì)照。空白對(duì)照主要測(cè)系統(tǒng)的吸光率。空白對(duì)照在單波長(zhǎng)測(cè)量時(shí)顯得尤其重要。第9頁(yè)/共18頁(yè)ELISA試劑常見問(wèn)題及解答ELISA試劑的原理基礎(chǔ)為抗原抗體免疫反應(yīng)，在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、使用等各環(huán)節(jié)中，對(duì)其質(zhì)量特性產(chǎn)生影響的因素眾多。此外，其顯色系統(tǒng)中的過(guò)氧化物酶在生物樣品中普遍存在，故在客戶使用過(guò)程中經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生某種非期望的結(jié)果。對(duì)問(wèn)題進(jìn)行客觀的分析、有針對(duì)性的解決問(wèn)題，不僅是用戶的希望，也是促進(jìn)我們自身產(chǎn)品質(zhì)量提高的關(guān)鍵。以下為ELISA試劑盒常見問(wèn)題處理對(duì)策：第10頁(yè)/共18頁(yè)顯色淺靈敏度低序號(hào)原因解決方法1試劑盒運(yùn)輸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，受高溫天氣影響，酶的活性降低。試劑運(yùn)輸過(guò)程加放足夠冰袋并盡可能縮短運(yùn)輸時(shí)間。2試劑盒（包括未用完的板條及其他組分）保藏條件不正確。試劑盒內(nèi)所有組分都應(yīng)當(dāng)在4℃冷藏，未使用完的板條要密封保存。3試劑盒使用時(shí)已超出有效期。過(guò)期試劑盒不可以使用。4溫育時(shí)間不夠。嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。5恒溫箱溫度達(dá)不到37℃。注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在37±0.5℃。盡量避免頻繁開關(guān)恒溫箱門。經(jīng)常注意水箱中合適的水位。在保證水不沒過(guò)酶標(biāo)板的前提下，使水位盡量高，以保證反應(yīng)溫度。第11頁(yè)/共18頁(yè)6加樣量不足；移液時(shí)抽吸排放過(guò)快，有氣泡、或吸頭內(nèi)殘留液體過(guò)多。經(jīng)常校正移液器。注意吸頭要與移液器吻合。移液不宜過(guò)快，排放要完全。7顯色劑加量不足，或加入順序顛倒。按照說(shuō)明書要求，先加入A液、后加入B液，并保證加入量。8樣品用NaN3防腐，影響了酶的活性。不可以使用NaN3防腐。9試劑、樣品使用前未平衡至室溫。試劑、樣品從低溫保藏條件中拿出來(lái)后，要先平衡至室溫方可以使用。10試劑開啟時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，污染。試劑開啟后應(yīng)該在盡可能短的時(shí)間內(nèi)用完，在保證正確貯存的前提最長(zhǎng)不要超過(guò)。12不同批號(hào)試劑中混用不同批號(hào)試劑不能混用第12頁(yè)/共18頁(yè)假陽(yáng)性多，本底高甚至花板

序號(hào)原因解決方法1試劑過(guò)期過(guò)期試劑不能使用2加樣時(shí)污染注意更換吸頭。盡可能避免污染。3加酶時(shí)污染對(duì)先加樣后加酶的操作，加酶時(shí)要注意吸頭不要接觸標(biāo)本，造成污染。當(dāng)可能造成污染時(shí)，一定要更換吸頭，切忌僥幸心理。4恒溫箱溫度過(guò)高注意控制恒溫箱溫度，盡可能讓其穩(wěn)定在37±0.5℃。5整個(gè)操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、造成反應(yīng)時(shí)間不同（第一孔與最后一孔反應(yīng)時(shí)間相差很懸殊）。氣溫高時(shí)更明顯。在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成操作。盡量不要堆積多塊板子操作（尤其手工操作時(shí)）。第13頁(yè)/共18頁(yè)6洗液稀釋倍數(shù)過(guò)高按照要求倍數(shù)稀釋洗液7洗板次數(shù)不夠按試劑要求，不可任意減少洗板次數(shù)8洗板時(shí)浸泡時(shí)間不夠按要求操作，并適當(dāng)延長(zhǎng)浸泡時(shí)間。9手工洗板方式不正確洗板時(shí)，垂直加入洗液，保證一定的沖擊力；洗液要注滿板孔，并保證30-60秒的浸泡時(shí)間。10洗板機(jī)調(diào)試不正確或者有故障（可通過(guò)手工洗板判定）手工洗板，并聯(lián)系儀器廠家維修。11酶被污染防止組分的污染。如使用容器，注意容器的清潔。12顯色液B液被污染13顯色完后沒有終止反應(yīng)。顯色完立即終止反應(yīng)。第14頁(yè)/共18頁(yè)重復(fù)性不好

1加樣量多少不一，操作時(shí)間長(zhǎng)短不一。重復(fù)同一樣品時(shí)，加樣量與加樣時(shí)間相同；同時(shí)注意移液器的校準(zhǔn)。加樣后應(yīng)該將酶標(biāo)板放置在微量振蕩器上，充分混合；標(biāo)本保證一致、無(wú)污染；盡可能由同一名操作人員操作。盡可能模擬相同的反應(yīng)條件。2加入標(biāo)本后沒有混勻。3重復(fù)實(shí)驗(yàn)的操作人員不同，操作習(xí)慣不同。4反