光合細菌Rhodopseudomonasacidophila的胞外聚合物的提取研究摘要：采用了五種不同的方法——EDTA、NaOH、H2SO4、熱提取和高速離心，對光合細菌Rhodopseudomonasacidophila的胞外聚合物（EPS）進行提取。結果表明，EDTA法是一種比較好的提取方法，提取效率高，對細胞破壞小。EPS中的多糖、蛋白和核酸含量分別為6.5、58.4、5.4mg/g干重。EDTA的適宜提取時間1～3h，用量約為2.8g/g干重。采用不同的提取方法，提取的EPS中的組分含量大不相同。本文還采用了兩種方法檢查細胞的破壞程度，一種是測定核酸含量，一種是測定光合細菌提取前后UV-Vis光譜和EPS的UV-Vis光譜，兩種方法的結果一致。EDTA提取方法中，細菌的UV－Vis峰強度在提取前后沒有變化，EPS溶液中也沒有新的色素峰出現，說明基本沒有細胞被破壞。由于UV－Vis光譜測定方便快速，可以用來監測在EPS提取過程中細胞的溶解情況。關鍵詞：胞外聚合物；光合細菌；UV-Vis光譜；蛋白；核酸；多糖；提取ExtractionoftheextracellularpolymericsubstancesfromaphotosyntheticbacteriumRhodopseudomonasacidophilaAbstract:Amongthefivemethodsforextractingextracellularpolymericsubstances(EPS)fromRhodopseudomonasacidophilausingEDTA,NaOH,H2SO4,heatingandhighspeedcentrifugation,EDTAextractionwasfoundtobethemosteffectivemethodbecauseofhigherextractionefficiencyandlowercelllysis.ThecontentsofthemajorcomponentsofEPSfromR.acidophila,i.e.,carbohydrate,proteinandnucleicacid,were6.5,58.4and5.4mg/gdrycell,respectively.Thefeasibleextractiontimewas1-3handtheEDTAdosagewasabout2.8g/gdrycellsforEDTAextraction.Twomethods,i.e.thecontentofnucleicacidandUV-Visspectrum,wereusedtoevaluatecelllysisduringextraction.TheabsorptionpeaksforphotosyntheticpigmentsinUV-VisspectrumseemednochangepriortoandafterEDTAextraction,andnopigmentpeaksappearedinthespectrumofEPS,indicatingthatfewcellsweredestroyedandthatlysisdidnotoccurduringEDTAextraction.TheUV-VisspectrumcouldbeusedtomonitorthecelllysisduringEPSextractionfromRacidophila.Keywords:Carbohydrate;Extracellularpolymericsubstances;Extraction;Nucleicacid;Rhodopseudomonasacidophila;UV-Visspectrum;Protein微生物利用有機廢水產氫已經引起了人們廣泛的興趣，其中光合細菌（PSB）被認為是最有應用前景的一種產氫微生物，文獻中報道一些光合細菌，例如Rhodobactersp.[1]，能夠利用低級有機酸作為電子受體，光作為能源，產生氫氣。從應用觀點看，光合細菌要能夠在光反應器中生長和連續產氫，反應器中微生物必須保持一定的濃度，但是，由于光合細菌的絮凝沉降性能不好[2]，不能有效的和溶液分離，在產氫光反應器中，光合細菌一般濃度都很低。為了解決這個問題，必須研究PSB的絮凝沉降特性。細菌的絮凝性能和胞外聚合物（EPS）有很大的關系。EPS是吸附在細菌表面的一些高分子聚合物（Mw>10000），主要來源是微生物分泌、細胞產物自溶和廢水中的有機物的吸附[3]。EPS的主要成分是多糖、蛋白和核酸，它們的含量對細菌的絮凝性能有著顯著的影響。EPS的研究最早應用于好氧活性污泥中，到目前為止，對水處理中好氧活性污泥和厭氧污泥、顆粒污泥、生物膜等已經進行了大量的研究[4－6]，但是對光合細菌的EPS特性研究很少。Watanabe等人[2]分離了一株海洋光合細菌，Rhodovulumsp.，并且研究了它的絮凝特性，他們認為胞外核酸的含量是影響光合細菌絮凝性能的最主要因素，但該株細菌能不能產氫沒有報道。本文選用了一株產氫光合細菌Rhodopseudomonsaacidophila，比較了幾種常用的不同的EPS提取方法的提取效率。基于比較結果，選擇EDTA作為提取方法，進一步研究提取時間和提取劑用量的對EPS提取的影響。而且，對EPS的UV-Vis和紅外光譜特性也進行的簡單的研究，并且提出了一個簡單方便的方法，用來判斷提取過程中的細胞破壞程度。1．材料與方法1.1光合細菌R.acidophila,從中國水產科學研究院東海水產研究所購得。這株光合細菌能夠利用乙酸、丙酸、丁酸產氫。在4000Lux，30oC下，當底物為1.8g/l乙酸、1.0g/l丙酸、0.4g/l丁酸的混和酸時，在208小時以內，該PSB能夠產生494ml氫氣，最大產氫速率為21.9ml/l/h。生長培養基成分為(每升)：KH2PO40.5g,K2HPO40.6g,NaCl0.4g,MgSO4?7H2O0.2g,CaCl2?2H2O0.05g,(NH4)2SO41.25g,琥珀酸鈉9.8g，1ml微量元素溶液。培養基的pH為7.0，培養溫度32oC，光照強度3000Lux，充氬氣保持厭氧環境。1.2EPS的提取方法采用五種方法從R.acidophila提取EPS，即EDTA、NaOH、H2SO4、熱處理和高速離心。分別取40mlPSB培養液，12000rpm，4oC離心10min，菌體用0.9%NaCl溶液洗滌兩次，然后重懸于10ml二蒸水中，再分別加入一定量的EDTA(2%)、NaOH(1N)、H2SO4(8%)溶液，4oC放置提取3h。為了比較，另取兩份，分別采用熱提取(70oC，1h)和高速離心方法提取EPS。然后，將細菌EPS溶液經4oC12000rpm離心15min，除去剩余的細菌，上清液為EPS溶液。因EDTA干擾蛋白的測定，將EDTA提取的EPS溶液對二蒸水透析過夜。最后，將所得的EPS溶液經0.45μm醋酸纖維素膜過濾，再進行成分分析。1.3分析方法多糖用蒽酮法測定，蛋白用Lowry法測定，核酸含量用紫外吸收法測定。Ca2+和Mg2+用原子吸收法測定(WFx-120，Rayleigh分析儀器公司)。為了測定EPS的紅外光譜，將兩倍預冷乙醇加入EPS溶液中，沉淀重懸于雙蒸水中，透析過夜，再用乙醇沉淀，沉淀物用乙醇洗滌兩次，最后真空干燥。干燥的沉淀物用于IR分析(VECTOR22,Bruker公司)。UV－Vis光譜用島津UV-2401PC儀器分析。2.結果與討論：2.1提取方法的比較不同提取方法的比較結果列于表1。結果表明，提取出的EPS量和提取方法有很大關系，其中，NaOH法，提取的EPS最多，熱處理和EDTA法次之，H2SO4法和高速離心最少。一個好的提取方法，不但提取效率要高，而且對細胞的破壞要少，一般核酸的含量用來評價提取過程中細胞破壞程度[7]。上述五種提取方法中，提取的EPS溶液中核酸含量大小順序為：NaOH>熱提取>EDTA>H2SO4>離心。用NaOH提取EPS，核酸的含量是用離心法的9.6倍，說明提取過程中細胞破壞嚴重，大量提取出來的EPS其實是胞內物質。同樣，熱提取的EPS中，核酸含量也很高。EDTA法、硫酸法和離心法對細胞破壞少，但是硫酸法和離心法提取的EPS量很少，提取效率低，不是一種有效的提取方法。結果表明，EDTA的提取效率高，對細胞的破壞少，是一種從R.acidophila中提取EPS的有效方法，比其他幾種方法要優越。用EDTA提取的EPS中多糖，蛋白、核酸的含量分別為6.5,58.4和5.4mg/g干重。在以后的實驗中，都采用EDTA法來提取EPS。從表中還可以看出，用不同的提取方法，提取的EPS量在12.9~159.2mg/g干重中變動，同樣多糖蛋白比值在0.06~1.71范圍內。由上述討論可知，EPS的提取方法和操作步驟同時影響提取的EPS的成分和含量。表1.不同方法從R.acidophila中提取的EPS的含量(mg/g干重)與多糖/蛋白比EDTANaOHH2SO4熱提取高速離心多糖6.57.710.610.34.1蛋白58.4126.66.237.76.2核酸5.424.94.623.62.6總EPS70.3159.221.471.612.9多糖/蛋白0.110.061.710.270.66從R.acidophila中提取的EPS中，蛋白的含量和Watanabe等人[2]從海水中分離的Rhodovulumsp.的EPS中蛋白含量基本相同，但是多糖和核酸的含量卻小于Rhodovulumsp.的EPS中的，Rhodovulumsp.的EPS中多糖/蛋白約為0.6，遠遠大于R.acidophilaEPS中的多糖/蛋白0.11。由于Rhodovulumsp.具有良好的絮凝性能，而R.acidophila絮凝性能相對較差，EPS的含量和物質成分的差別可能也是一部分原因，Watanabe等認為胞外核酸在細菌的絮凝性能中起主導作用。2.2提取時間和提取劑用量的影響從圖1和2可以看出，EPS中蛋白含量受提取時間和提取劑用量影響很大，而多糖和核酸幾乎不受影響。當提取時間超過1h，EPS的含量基本保持不變，維持在48.4，7.5和7.3mg/g干重左右。EDTA的提取速度快，可能是由于EDTA和二價離子的絡合反應速度很快。從圖2(A)中可以得出，當EDTA的用量從0.8增加到2.8g/g干重時，EPS的量也從29.9迅速增加到84.3mg/g干重，然而當EDTA用量繼續增加時，提取的EPS的量基本保持不變。這和細菌培養液中多價離子含量有限有關，當多價離子都被EDTA絡合后，再增加EDTA的量，將不會顯著的提高EPS的提取效率。從圖2(B)中可以看出，Ca2+和Mg2+的含量隨著EDTA的用量增加而增加，到2.8g/g干重之后，這些二價離子的濃度都基本上保持不變或略有降低。這些二價離子的濃度和蛋白的濃度有一定的相關性，EPS中Ca2+和Mg2+的含量增高，蛋白的含量也增大，說明在細菌EPS中，這些二價離子是主要和蛋白結合的，因為在中性條件下，蛋白質的羧基會離解而帶負電，然后就靠這些二價離子通過離子橋接把EPS和細菌結合在一起。當EDTA除去這些離子時，EPS也就隨之釋放到溶液中去了。圖1.提取時間對EPSS量的影響圖2.提取劑用量的影響響：(A)EPS量；(B)Caa2+和Mg2+含量EPS中三種主要物質的提取難易程度也有所不同，從圖2可以看出，用EDTA提取，多糖和核酸比較容易提取，在少量的EDTA存在下，較短的時間就能提取比較完全，而蛋白比較難提取，很大的EDTA劑量才能提取比較完全。這說明，提取的操作也同時影響著提取的EPS的量和成分。2.3EPS紅外光譜圖3是從R.acidophila中提取的EPS的紅外光譜圖。譜圖中有五個很明顯的峰：3422，2923，1635，1395，1055cm-1，其中3422處峰是OH伸展振動產生的，2923處的較弱的峰是C－H振動峰，而1635和1395處是羧基中C=O不對稱和對稱伸展振動峰。處于1000~1200處的吸收峰一般為糖衍生物的典型吸收峰。從紅外光譜譜圖中，我們可以知道，EPS中含有的最主要的活性基團是羧基和羥基。2.4UV－Vis光譜圖3.R.accidophhila的EPS的紅外光譜譜圖4.A：EPSS提取前后R.aciddophilla溶液UV-Viis光譜；B：EDTA和NaOH提取的EPSUUV－Vis光譜圖4(A)為PSB提取前和經EDTA和NaOH提取后的UV-Vis光譜圖，圖4(B)為從PSB中提取的EPS的Uv-Vis譜圖。從圖4(A)可以看到細胞色素的幾個典型吸收峰，590，800，860nm，如果在提取過程中細胞被破壞，胞內物質泄漏出來，則提取前后細胞的吸收峰強度在譜圖上就應該可以看出發生了改變，而且在EPS譜圖上應該也可以觀察到類似的吸收峰，因而，可以利用UV－Vis譜圖來判斷提取過程對細胞的破壞程度。從圖上可以看出，EDTA提取前后細胞色素峰的強度幾乎沒有改變，EDTA提取的EPS的UV-Vis譜圖上也沒有色素峰的出現；而經過NaOH提取，細胞懸浮液的峰強度明顯減弱，甚至消失，而在NaOH提取的EPS譜圖上，液可以看到有色素峰的出現。這個現象說明，EDTA提取方法對細胞破壞少，而NaOH方法細胞破壞卻很嚴重，這個結果也和前述核酸數據相符。細胞破壞程度是判斷一種提取方法是否恰當的一個重要指標，很難估計，缺少一個標準判斷方法。以前一般用蛋白或者核酸的含量來判斷，但是EPS本身中也含有大量的蛋白和核酸，所有這種方法并不是很恰當，后來有用ATP或葡萄糖－6－磷酸脫氫酶這些胞內物質的含量來判斷[7]，可是這些物質的測量方法都很費時費事，使用中受限。UV－Vis作為一種快速方便的方法，可以用來評價EPS提取過程中的細胞破壞程度。3.結論：從R.acidophilaEPS的提取方法比較來看，EDTA法的提取效率高，對細胞的破壞程度小，是一種較好的提取EPS的方法。用EDTA法提取的EPS量為70.3mg/g干重。EDTA的適宜提取時間約為1～3h，提取劑量約為2.8gEDTA/g干重。提取方法，提取時間和提取劑的用量都會影響提取的EPS的量和成分。同樣，從EPS和細菌的UV－Vis數據中同樣可以看出，EDTA對細胞的破壞較小，而NaOH破壞很大。提取過程中細胞的破壞程度是判斷一種提取方法優劣的一個重要指標，但目前缺少一個標準判斷方法，UV－Vis法作用一種方便快速的方法，有可能用來判斷EPS提取過程中細胞的破壞程度。參考文獻[1]ErogluI,AslanK,GunduzU,YucelM,TurkerL.SubstrateconsumptionratesforhydrogenproductionbyRhodobactersphaeroidesinacolumnphotobioreactor.JBiotechnol,1999,70:103-113[2]WatanabeM,SasakiK,NakashimadaY,KakizonoT,NoparatnarapornN,NishioN.GrowthandflocculationofamarinephotosyntheticbacteriumRhodovulumsp.ApplMicrobiolBiotechnol,1998,50:682-691[3]MorganJW,ForsterCF,EvisonL.Acomparativestudyofthenatureofbiopolymersextractedfromanaero