實驗一：葡萄糖含量的測定——碘量法

實驗目的:通過此實驗要求學生掌握碘量法測定葡萄糖的基本原理掌握間接碘量法測定葡萄糖的操作方法。實驗原理:碘與NaOH作用發生歧化反應生成具有氧化能力的次碘酸鈉（NaIO），而葡萄糖能定量地被NaIO氧化。在酸性條件下，未與C6H12O6作用的NaIO又可轉變成I2析出，因此只要用硫代硫酸鈉（Na2S2O3）標準溶液滴定析出的I2，便可計算出C6H12O6的含量。其反應過程式如下：1．I2歧化反應：

I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2O2．

氧化反應：

C6H12O6+NaIO=C6H12O7（葡萄糖酸）+NaI3．

NaIO歧化反應：與C6H12O6作用完后，剩下的NaIO在堿性條件下發生歧化反應：3NaIO=NaIO3+2NaI4．

酸化：NaIO3+5NaI+6HCl=3I2+6NaCl+3H2O析出的I2：I2+2Na2S2O3=Na2S4O6（連四硫酸鈉）+2NaI實驗器材與試劑：

器材：移液管，滴定儀或滴定管，碘量瓶試劑：0.05mol.L-1碘標準溶液。0.10mol.L-1Na2S2O3標準溶液。2mol.L-1NaOH溶液6mol.L-1鹽酸溶液

1%淀粉待測葡萄糖溶液（約1%）碘量法是氧化還原滴定法中，應用比較廣泛的一種方法。碘可做為氧化劑而被中強的還原劑（如Sn2+，H2S）等所還原．直接碘量法是供試液液就是你所測的物質和碘反應,當碘稍過量時,淀粉和碘反應顯藍色,這就是反應終點.

間接碘量法是加入定量的碘化鉀,溴試劑等,生成碘,加淀粉顯藍色,然后加入硫代硫酸鈉與碘反應,滴定終點為藍色消失.實驗過程：1.用移液管吸取10ml待測溶液放入碘量瓶中，準確加入5mlI2標準溶液。2.邊加邊搖動的情況下慢慢加入2mol/L-1NaOH溶液至溶液呈淡黃色。3.將碘量瓶加蓋放置10—15分鐘。4.加6mol/L-1鹽酸于碘量瓶中使成為酸性。5.立即用Na2S2O3溶液滴定至溶液呈淡黃色。6.加入2ml淀粉指示劑，繼續滴定至藍色消失為止。7.記錄滴定所消耗的Na2S2O3的量。重復試驗一次。葡萄含量的計算：C6H12O6（g.L-1）={[（CI2VI2——1/2CNa2S2O3VNa2S2O3）

×MC6H12O6/1000]/10.00}×1000。

思考與分析：

1.碘量法測定葡萄糖的主要誤差來源有哪些，應如何避免？2.間接碘量法為什么既可測定還原性物質又可以測定氧化性物質？測定時應如何控制溶液的酸堿性？為什么？3.為什么加堿速度不能過快，如果過快則對葡萄糖的測定結果有何影響？實驗二：總糖與還原糖測定

實驗目的：通過本實驗要求學生掌握還原糖和總糖的測定原理，掌握用比色法測定還原糖的操作方法。實驗原理：

本實驗是利用3.5一二硝酸水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定濃度范圍內，還原糖的量和棕紅色物質顏色的深淺程度成一定比例關系。通過測定540nm處的吸收值就可求出糖的含量。此法快速簡便，雜質干擾小，但糖含量超過一定范圍就會測不準確。實驗器材及試劑：

儀器：容量瓶（100ml），漏斗，吸管，量筒，試管，燒杯，三角瓶，分光光度計，恒溫水浴鍋試劑：①3.5一二硝基水楊酸（DNS）試劑（6.3gDNS和262ml2mol.L-1NaOH，加到500ml含有182g酒石酸鉀鈉的熱溶液中，再加5g重蒸酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加水定容至1000ml，貯于棕色瓶中。②1000ug/ml葡萄糖標準溶液：準確稱取干燥恒重的葡萄糖1.000g，加水溶解后加8ml濃鹽酸，加水定容至1000ml。③6mol.L-1鹽酸。④6mol.L-1NaOH。

實驗過程：

1．標準曲線的制作：1）取5支試管按下表配制不同濃度的葡萄糖標準溶液。管號1000ug/ml葡萄糖（ml）H2O（ml）葡萄糖終濃度（ug/ml）1191002282003373004464005555002）另取6支試管按下表加入各種溶液，制作標準曲線。管號

H2O100ug/200ug/300ug/400ug/500ug/DNSml

葡萄糖

mlGlcmlGlcmlGlcmlGlc10.5ml0.5ml20.5ml0.5ml30.5ml0.5ml40.5ml0.5ml50.5ml0.5ml60.5ml0.5ml混勻后沸水浴加熱5min，取出冷卻，加入4ml水混勻，以1號管作空白調零，測定其OD540以葡萄糖含量（ug）為橫坐標，光密度值為縱坐標作標準曲線。2．淀粉中還原糖的測定：稱取淀粉1.00g放入燒杯中。用少量水調成糊狀。加50—60ml水搖勻。50℃保溫20min，使還原糖浸出。定容至100ml。過濾。取濾液0.5ml測定還原糖。方法與標準曲線制作相同。3．淀粉中總糖的測定：

稱取淀粉0.5g，放入三角瓶中。加入6mol.L-1鹽酸10ml，水15ml。沸水浴中加熱水解30min。冷卻后加入6mol.L-1NaOH溶液調節至PH中性。水解液定容至100ml。過濾。取濾液10ml。稀釋至100ml，即為稀釋1000倍的總糖水解液。取稀釋液0.5ml測定還原糖，方法與葡萄糖標準曲線制作相同。將樣品中所測得的OD值，在標準曲線上查出相應的還原糖量，計算出淀粉中還原糖和總糖的百分含量。思考與分析：1．除此法外還有哪些方法可以測定總糖和還原糖？2．此法與其它測定糖含量的方法相比有何優缺點？3．在總糖的測定中為什么不直接用水解液來測定而要稀釋后來測定。實驗三：蛋白質含量的測定——雙縮脲法

實驗目的：

掌握雙縮脲法測定蛋白質含量的其本原理，掌握雙縮脲法測定蛋白質含量的操作方法。實驗原理：兩個尿素分子在加熱的情況下失去一分子氨而形成雙縮脲分子，雙縮脲分子能與堿性硫酸銅形成粉紅色的絡合物稱為雙縮脲反應。蛋白質分子中因含有多個肽鍵，因此也有雙縮脲反應，在堿性條件下蛋白質與Cu2+形成紫紅色絡合物，其顏色的深淺與蛋白質的含量成正比，此顏色最大吸收峰波長在540nm處，故可通過測定其吸收值來測定蛋白質含量。此法只與蛋白質的含量有關而與蛋白質的分子量、氨基酸成分無關，但以氨基酸、Tris、肽作緩沖溶液時，反應呈陽性。此法快速簡便，但靈敏度較差，測定范圍每毫升1—10毫克蛋白質。實驗器材與試劑：器材：試管，移液管，721分光光度計，恒溫水浴鍋。試劑：①雙縮脲試劑：取1.5gCuSO4.5H2O和6.0g酒石酸鉀鈉用500ml水溶解后在攪拌下加入300ml10%NaOH溶液，再用水稀釋至1升。②標準蛋白溶液：10mg/mL牛血清白蛋白溶液。③未知濃度蛋白溶液（1：100的雞蛋清稀釋液）。實驗過程：

1．標準曲線的制定：取12支試管分成兩組按下表分別加入試劑。試管號123456標準蛋白液（ml）00.20.40.60.81.0水（ml）1.00.80.60.40.20雙縮脲試劑（ml）444444充分搖勻后,恒溫水浴25℃保溫30min，以1號試管作對照調零測定其它試管540nm處的吸收值。取兩組測定的平均值，以蛋白質含量作橫坐標，吸收值為縱坐標繪制標準曲線。2．樣品的測定：取兩支試管各加入未知濃度蛋白液1ml，加入雙縮脲試劑4ml25℃保溫30min，測定540nm吸收值，通過此吸收值在標準曲線上查出樣品中蛋白質的含量。思考與分析：1．蛋白質含量的測定除雙縮脲法外，還有哪些方法，與雙縮脲法比較各有何優缺點？2．有哪些因素影響其測定結果？實驗四：維生素C的定量測定實驗目的：掌握碘量法測定維生素C含量的原理。掌握維生素C含量測定的操作方法。實驗原理：在酸性條件下，碘氧化還原型維生素C，維生素C生成氧化型，而碘被還原成無色的I-，過量的碘與淀粉生成蘭色，即為終點。實驗試劑：2%草酸溶液：草酸2g溶于100ml蒸餾水1%草酸溶液：溶1g草酸于100ml蒸餾水標準抗壞血酸溶液：準確稱取50.0mg純抗壞血酸，溶于1%草酸溶液，并稀釋至500ml。（貯棕色瓶，冷藏，最好臨用時配置）O.05mol/L碘液實驗步驟：1、維生素C的提取：洗凈蔬菜或水果、擦干稱取20g蔬菜或水果加2%草酸少許研磨成糊狀用2%草酸定容100ml過濾（最初數毫升濾液棄去）濾液備用2.標準液滴定：

準確吸取標準抗壞血酸溶液1.0ml（含0.1mg抗壞血酸），置150ml錐型瓶中。加1淀粉液用碘液滴定至藍色出現，并保持15s不褪色即為終點。由所用碘的體積計算出1ml碘液相當于多少mg抗壞血酸。3.樣品滴定取濾液20ml，加1ml淀粉液，用碘液滴定至蘭色出現4.計算：V×TW×100=100g樣品中含壞血酸mg數V=滴定樣品時所用去的碘ml數T=1ml碘液相當于抗壞血酸mg數W=20ml樣液相當于含樣品的克數1.滴定速度為什么要迅速（一般不超過2分鐘）。2.為什么最初數毫升濾液要棄去。3.有哪些因素影響測定結果。思考與分析：實驗五：酵母RNA的提取與鑒定

實驗目的：

1．掌握RNA的提取原理與方法。2．掌握鑒定核酸組分的方法。實驗原理：酵母核酸中RNA的含量較高，RNA可溶于堿性溶液，而DNA不溶，用堿性溶液提取可使RNA與DNA分開，在提取液中加入酸性乙醇可使解聚的RNA沉淀而得到RNA的粗制品。

RNA含有核糖.嘌呤堿.嘧啶堿和磷酸等組分，加硫酸煮沸后可使RNA完全水解成各組分，從水解液中可以測定出各組分的存在。1．核糖的鑒定：核糖+濃鹽酸糠醛,糠醛+苔黑酚——綠色物質。2．磷酸的鑒定：PO43-+3NH4++12MoO42-+24H+→（NH4）3PO4.12MoO3.6H2O↓+6H2O黃色磷鉬酸銨在有還原劑存在時（VitC）Mo6+被還原成Mo4+，Mo4+再與MoO42-結合成Mo(MoO4)2或Mo3O8而呈藍色即鉬藍。3．嘌呤堿的鑒定：嘌呤堿+Ag+→嘌呤銀（絮狀物沉淀）

實驗器材及試劑：

器材：燒杯，三角瓶，試管，移液管，離心管，乳缽,量筒，水浴鍋，離心機，。試劑：酵母片0.04mol.L-1NaOH,1.5mol.L-1硫酸酸性乙醇（30ml乙醇加入0.3ml濃鹽酸）95%乙醇,濃氨水0.1mol.L-1AgNO3，苔黑酚乙醇液（6g苔黑酚溶于100ml95%乙醇）FeCl3濃HCl液（2ml10%FeCl3加入到400ml濃鹽酸中）定磷試劑：17%H2SO4：2.5%鉬酸銨：10%VitC：水=1：1：1：2（V/V）（臨用時混合）。實驗過程：1．RNA的提取：取12片酵母片，用乳缽研磨成粉末，加入30ml0.04mol.L-1NaOH溶液合并于三角瓶中，沸水浴上加熱30min。冷卻。3000rpm離心15分鐘，取出上清液，攪拌下緩慢加入10ml酸性乙醇溶液。待RNA沉淀完全后，3000rpm離心15min，棄去上清液，沉淀用95%乙醇洗滌一次，沉淀備用。2．RNA的水解：將以上提取的RNA全部放入一支試管內，加入1.5mol.L-1H2SO45ml，沸水浴中加熱10分鐘，3．組成鑒定：①嘌呤堿的鑒定：取水解液1ml，加入2ml濃氨水，然后加入1ml0.1mol.L-1AgNO3，觀察實驗現象。②磷酸的鑒定：取1ml水解液，加入1ml定磷試劑，沸水浴加熱5分鐘，觀察實驗現象。③核糖的鑒定：取1ml水解液加入FeCl3-濃HCl2ml和苔黑酚乙醇溶液0.5ml，沸水溶加熱10分鐘，觀察實驗現象。思考與分析

1．在嘌呤堿鑒定中，為什么要加入過量濃氨水？2．定磷試劑中維生素C起什么作用？如果維生素C已被氧化成紅色，則對實驗有何影響？3．此法從酵母中分離的RNA是mRNA，tRNA，rRNA還是總RNA？如果要分離出純的mRNA，下一步如何做？實驗六：DNA的瓊脂糖凝膠電泳1．瓊脂糖凝膠的準備：稱取0.3g瓊脂糖置于三角瓶中，加入30mLTBE緩沖液，用小燒杯反扣三角瓶口，放入微波爐中加熱（1分鐘）至瓊脂糖全部融化后取出，待凝膠溫度冷卻至60—70℃時，將凝膠倒入凝膠盒中，在膠盒一端裝上樣品槽板（即梳子），室溫放置0.5—1小時，待凝膠全部凝固，取下樣品槽板，將凝膠放入灌好電極緩沖液的電泳槽中。實驗過程2．加樣：將DNA樣品與溴酚藍指示劑按5：1（V/V）比例混合，用移液器取混合好后的DNA樣品10uL加入凝膠樣品槽中。3．電泳：將點樣端接負極，另一端接正極，通電調節電壓50V，電流40mA。電泳至溴酚藍距另一端1cm停止電泳。4．染色：從電泳槽中取出凝膠，放入培養皿或白瓷盤中，加入溴化乙錠染色液覆蓋凝膠浸泡30分鐘，取出凝膠，用水稍沖洗凝膠。5．觀察：將凝膠放在暗室（或暗處）用紫外分析儀照射凝膠，觀察凝膠中橙黃色熒光的DNA譜帶，測量每條DNA譜帶的遷移位置，求出Rf值。（注意：染色和觀察時帶手套操作，避免染色液滴灑周圍環境）。思考與分析：根據λDNA/EcoRI電泳圖譜：測量每條譜帶的遷移位置，計算出Rf值，根據Rf與lgM成反比作標準曲線。（λDNA/EcoRI六個片段分別是：13.7×106，4.74×106,3.73×106,3.48×106,3.02×106,2.13×106）實驗八：血清谷丙轉氨酶（SGPT）測定一、目的要求：（1）掌握血清谷丙轉氨酶活力測定的原理及方法。（2）制備標準曲線，測定血清谷丙轉氨酶活性。（3）學習如何設計實驗二、原理：生物機體內轉氨基作用是—氨基酸的氨基通過酶促作用轉移到α—酮酸的酮基位置上，生成相應的酮酸與氨基酸的化學反應。催化這反應的酶稱為轉氨酶（transaminase），其輔酶為磷酸吡哆醛。轉氨酶廣泛存在于機體的各種組織中，在肝、心、腎等組織中的谷丙轉氨酶(glutamicpyruvictransaminase,GPT)，谷草轉氨酶(glutamicoxalacetictransaminase.GOT)活性較高。在正常新陳代謝過程中，血清內維持一定水平的轉氨酶活性（即正常值）。當肝、心、腎等組織發生病變時，由于組織細胞腫脹，壞死導致大量的酶釋放至血流中，從而引起血清谷丙