超高效液相色譜-串聯質譜法測定阿膠中馬、牛、羊、豬、駱

駝、鹿皮源成分杭寶建;田晨穎;陳曉;邢晟;石峰;冷佳蔚;鞏麗萍【摘要】Amethodwasestablishedfordetectingtheingredientsofhorse,ox,sheep,pig,camelanddeerskinincollacoriiasiniusingultraperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry(UPLC-MS/MS).Theoreticalmarkerpeptideswereselectedbycomparingthecollagensequencesintheskinsofdonkeys,horses,oxen,sheep,pigs,camels,anddeer.MarkerpeptideswereidentifiedbyproteasecuttingtechniquesandhighresolutionmassspectrometryandthenanalyzedbyUPLC-MS/MS.TheseparationwasperformedonaUPLCsystemwithaBEHC18columnviathegradientelutionofacetonitrilecontaining0.1%(v/v)aceticacidandwatercontaining0.1%(v/v)aceticacid.Themarkerpeptideswereidentifiedinthemodesofelectrospraypositiveionization(ESI+)andmultiplereactionmonitoring(MRM).Themarkerpeptidesforthehorse,ox,sheep,pigandcamelskinweredetectedin15samples.Themethodissimple,highlyreproducible,andsuitablefortheidentificationofmixedskiningredi-entsincollacoriiasini.Ithasbeensuccessfullyusedtodetecttheauthenticityofcollacoriiasini.%建立了阿膠中馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮源成分的檢測方法.通過比對驢皮和馬皮、牛皮、豬皮、羊皮、駱駝皮、鹿皮膠原蛋白的序列，采用蛋白酶切技術和高分辨質譜技術發現理論的各雜皮膠原蛋白特征肽.同時建立三重四極桿質譜篩查方法，以含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液和0.1%(v/v)甲酸水溶液作為流動相，梯度洗脫,電噴霧離子源(ESI)正離子掃描模式，多反應監測.15批阿膠樣品檢出了雜皮源成分.該方法操作簡便，專屬性強，可用于阿膠中雜皮源成分的鑒別，并已成功用于阿膠日常打假監督抽驗工作.【期刊名稱】《色譜》【年(卷)，期】2018(036)004【總頁數】5頁(P408-412)【關鍵詞】超高效液相色譜-串聯質譜;特征肽;膠原蛋白;阿膠【作者】杭寶建;田晨穎;陳曉;邢晟;石峰;冷佳蔚;鞏麗萍【作者單位】山東省食品藥品檢驗研究院,山東濟南250101;山東中醫藥大學,山東濟南250355;山東省食品藥品檢驗研究院仙東濟南250101;山東省食品藥品檢驗研究院仙東濟南250101;山東省食品藥品檢驗研究院仙東濟南250101;山東省食品藥品檢驗研究院,山東濟南250101;山東省食品藥品檢驗研究院,山東濟南250101【正文語種】中文【中圖分類】O658阿膠出現于先秦，至漢代已成為常用藥物,具有補血益氣、滋潤養顏、提高機體免疫力等功能，可用于失血貧血、缺鐵貧血、再生障礙貧血及年老體弱、兒童、婦女的滋補［1-4］。近年來，驢皮資源短缺，阿膠生產企業為了解決原料緊缺問題及降低成本,采用供應量大的馬、牛、豬、羊、駱駝、鹿皮等低值皮進行摻假，而現有標準僅對牛皮源成分進行控制,未控制上述其余雜皮的檢查，因此急需對現有標準進行提升。皮的主要成分膠原蛋白經高溫熬制后成為不完全水解的肽段,不同物種的膠原蛋白經胰蛋白酶酶切后可形成物種特異性的多肽［3-5］。本研究參考文獻［6-8］,采用蛋白酶酶切技術和質譜多肽識別技術建立了馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿等非驢皮源成分的摻假鑒別方法，可有效控制阿膠摻假現象，提升產品品質。表1幾種動物特征肽的序列及離子信息Table1SequenceandioninformationofthemarkerpeptidesofseveralkindsofanimalsMarkerpeptideSequencetR/minParention(m/z)Production(m/z)Cone/VCollisionenergy/eVHorseGASGPAGVR2.95386.4377.4*4022322.34021OxGEGGPQGPR1.54427.9668.4*5025329.45026SheepGFPGSDGVAGPK(3hydroxylation)10.08553.0450.9*5221787.55235PigGPTGPAGVR6.29406.5657.6*4525556.64524CamelSGHPGTVGPAGLR9.31407.9416.1*4019570.24016DeerSGETGASGPPGFAGEK(10hydroxylation)9.75732.8875.6*4738962.64737*Quantitativeion.本研究通過提取阿膠原材料驢皮及摻假馬、牛、豬、羊、駱駝、鹿等雜皮的膠原蛋白,采用蛋白質組學技術，將驢皮與摻假皮源進行蛋白質組比對，找出各雜皮的理論特征肽，同時采用高分辨質譜結合蛋白搜庫技術對理論特征肽進行序列及結構的驗證，根據確證的雜皮特征肽，采用超高效液相色譜-串聯質譜法建立了馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿等非驢皮源成分的摻假鑒別方法，可有效控制阿膠摻假現象，提升產品品質。1實驗部分1.1儀器與試藥ABSCIEXTripleQuad6500+超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀(AB公司)；KQ-300GDV型恒溫數控超聲器(昆山市超聲儀器有限公司);Vortex-6渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。甲醇、乙腈均為色譜純（德國Merck公司）、甲酸為色譜純（美國Fisher公司）,胰蛋白酶為優級純（美國西格瑪公司）,水為去離子水（Milli-Q純水系統生產）碳酸氫銨為分析純（上海國藥集團）。對照品:馬皮特征肽、牛皮特征肽、羊皮特征肽、豬皮特征肽、駱駝皮特征肽、鹿皮特征肽對照品均由上海強耀生物有限公司合成,純度為98%。樣品:研究用阿膠、馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮膠樣品為實驗室自制，其余阿膠樣品為日常監督抽驗樣品，共15批。1.2馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮特征的序列鑒別本工作參考文獻[9],通過提取阿膠原材料驢皮及摻假馬、牛、豬、羊、駱駝、鹿等雜皮的膠原蛋白,采用蛋白質組學技術，將驢皮與摻假皮源進行蛋白質組比對,找出各雜皮的理論特征肽，同時采用高分辨質譜結合蛋白質搜庫技術對理論特征肽進行序列及結構的驗證，序列見表1。1.3色譜、質譜條件液相色譜條件:色譜柱為ACQUITYUPLC?BEHC18（100mmx2.1mm,1.7pm）,流速0.3mL/min,流動相A為0.1%甲酸溶液,B為0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫程序:0~3min,4%B;3~8min,4%B~8%B;8-15min,8%B~50%B;15~16min,50%B;16~16.1min,4%B;16.1~25min,4%B;流速:0.3mL/min。質譜條件:電噴霧離子源（ESI）正離子掃描模式,多反應監測;離子源溫度:550°C。定性、定量離子對、錐孔電壓、碰撞能量見表1。1.4標準溶液及樣品溶液的制備標準溶液:取研究用自制阿膠樣品0.1^置于50mL量瓶中,加入質量分數約為1%的NH4HCO3水溶液（1g固體,加入100mL水溶解）40mL,超聲處理30min,使樣品完全溶解并加1%NH4HCO3水溶液定容至刻度，搖勻，得阿膠基質溶液。分別取馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮特征肽適量，加阿膠基質溶液制成各特征肽質量濃度為2pg/mL的溶液作為標準儲備溶液。系列標準溶液用阿膠基質溶液配制，現用現配。樣品溶液:取胰蛋白酶適量，加1%NH4HCO3溶液溶解，制成質量濃度為1pg/pL的胰蛋白酶溶液。取阿膠樣品0.19置于50mL量瓶中，加1%NH4HCO3溶液40mL,超聲處理30min,使樣品完全溶解并加入上述1%NH4HCO3溶液定容至刻度，過0.22pm濾膜敞100pL續濾液至300pL微量進樣瓶中，同時加入上述1pg/pL的胰蛋白酶溶液10pL,搖勻,37°C恒溫酶解12h,即得。表2幾種動物特征肽的線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限及定量限Table2Linearranges,regressionequations,correlationcoefficients(R2),LODsandLOQsforthemarkerpeptidesofseveralkindsofanimalsMarkerpeptideLinearrange/(mg/L)RegressionequationR2LOD/(ng/kg)LOQ/(ng/kg)Horse0.022.0Y=3.052x107X+1.369x1060.9998933Ox0.022.0Y=9.077x107X+1.808x1060.99721960Sheep0.022.0Y=6.208x108X+2.101x1070.999128Pig0.022.0Y=1.697x107X+3.010x1050.998739120Camel0.022.0Y=2.839x106X+9.242x1040.99901030Deer0.022.0Y=1.742x107X+1.715x1050.999950160Y:peakareaofmarkerpeptide;X:massconcentrationofmarkerpeptide,mg/L.2結果與討論2.1特征肽的發現阿膠中的主要成分為驢皮膠原蛋白水解后的多肽。皮類膠原蛋白主要由I型膠原蛋白組成[10],占膠原蛋白總量的80%~85%,I型膠原蛋白又包括I型a1、a2亞型。通過對馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿的I型a1、a2膠原蛋白序列進行blast多序列比對，發現了膠原蛋白COL1a2之間的差異序列,進一步模擬胰蛋白酶酶切膠原蛋白獲得物種相對的理論特征肽段。如果al特征序列數據庫中沒有找到特征序列，就在a2中找，如果a2中沒有，則嘗試在其他類型膠原蛋白中找，最終找出理論特征肽，并通過高分辨質譜對各特征肽進行驗證，各特征肽碎片歸屬均與數據庫中信息一致。2.2質譜參數的優化質譜的錐孔電壓、碰撞能對待測物的裂解有重要的影響，配制100ng/mL的各特征肽的單一標準溶液進行質譜條件優化:在電噴霧正離子模式下，通過蠕動泵直接進樣方式,確定待測物母離子;逐漸改變碰撞能量，通過觀察離子的豐度變化并與高分辨質譜碎片歸屬相結合確定定量離子、定性離子;最終通過優化質譜參數,確定碎裂電壓及碰撞能量。2.3專屬性實驗以馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮膠樣品為陽性樣品以自制阿膠樣品為陰性樣品，選擇馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮特征肽檢測離子對進行測定[11,12],結果見圖1。在這幾種陽性樣品中，各特征肽對照品相應的保留時間位置上均呈現出各相應皮特征肽離子流色譜峰，兩兩間各特征肽互不檢出,說明每一特征肽相對于其他5個物種是具有特征性的。阿膠樣品的色譜圖中,在與馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮膠樣品相應的位置上均無相應的色譜峰，因此認為所選各特征肽具有一定的代表性,且阿膠樣品對測定無干擾。圖1(a)阿膠和(b)幾種動物特征肽對照品的MRM色譜圖Fig.1MRMchromatogramsof(a)collacoriiasiniand(b)markerpeptidesofseveralkindsofanimals2.4標準曲線、線性范圍及檢出限取系列標準溶液進樣,按上述色譜條件測得峰面積。以峰面積為縱坐標，各特征肽對照品質量濃度為橫坐標,繪制標準曲線，結果表明各組分在0.02~2.0mg/L內線性關系良好，線性方程、相關系數見表2。在阿膠樣品中添加適量的標準工作溶液后，以3倍信噪比計算檢出限以10倍信噪比計算定量限，結果見表2。2.5重復性試驗取同一樣品，按1.4節方法平行制備6份供試品溶液，以監測離子對進行測定，馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮膠特征肽峰面積的RSD分別為6.8%、6.1%、6.3%、6.9%、6.9%和1.5%。2.6穩定性試驗取研究用同一樣品，平行制備6份樣品溶液,將6份樣品置于-20°C條件下分別冷凍1天、7天、14天、30天、45天、60天后，融化后室溫進樣,以監測離子對進行檢測，結果均可檢出各特征肽，說明酶解樣品在冷凍條件下60天內均穩定。2.7不同工藝對雜皮膠特征肽檢出的影響由于阿膠生產廠家較多，各廠家之間工藝差別較大，因此實驗模擬了弱（100C水解2h）、中（120C水解2h）、強（125C水解4h）3種程度的熬膠條件，制備出不同制膠工藝下這幾種雜皮膠樣品,以各特征肽離子對進行檢測。由表3結果可見,3種條件下制備的膠類樣品中均可以檢出相應特征肽。表3不同工藝對幾種動物特征肽檢出的影響Table3EffectsofdifferentprocessesonthemarkerpeptidesofseveralkindsofanimalsProcessContents/（mg/g）HorseOxSheepPigCamelDeerWeak0.500.310.0330.090.300.37Middle0.530.310.0330.100.300.37Strong0.500.300.0320.090.300.38Weak:hydrolysisfor2hat100C;middle:hydrolysisfor2hat120C;strong:hydrolysisfor2hat125C.2.8樣品測定以所建立的方法對15批阿膠樣品進行檢驗，結果表明,14批樣品檢出馬源性成分,6批樣品檢出牛源性成分,1批樣品檢出羊源性成分,2批樣品檢出豬源性成分,1批樣品檢出駱駝源性成分(見表4)。表4阿膠樣品中雜皮源成分檢測結果Table4TestresultsofmiscellaneousskiningredientsincollacoriiasinisamplesSampleNo.Contents/(mg/g)HorseOxSheepPigCamelDeer10.60NDNDNDNDND20.091NDNDNDNDND321.140.003NDNDNDND40.51NDNDNDNDND534.080.0940.1511.65NDND60.13NDNDNDNDND70.50NDNDNDNDND843.840.007NDNDNDND9NDNDNDNDNDND100.16NDNDNDNDND1112.730.003NDNDNDND1236.480.002NDNDND0.151336.310.004ND1.41NDND1435.28NDNDNDNDND150.40NDNDNDNDNDND:notdetected.3結論本文建立了超高效液相色譜-串聯質譜測定阿膠中馬、牛、羊、豬、駱駝、鹿皮源成分的檢測方法，樣品前處理操作簡單,方法專屬性強。實驗結果表明本方法具有較好的靈敏度、特異性和精密度，能滿足阿膠中雜皮源成分的檢測要求,15批日常抽檢阿膠樣品不同程度地檢出了摻假成分，因此非常有必要建立阿膠中雜皮源成分的檢測方法，以提升產品質量,為阿膠品質的監控提供技術支持。參考文獻：PharmacopoeiaCommissionofthePeople'sRepublicofChina.PharmacopoeiaofthePeople'sRepublicofChina,Part1.Beijing:ChinaMedicalSciencePress,2015:189國家藥典委員會.中華人民共和國藥典,一部.北京:中國醫藥科技出版社,2015:189ZhangGF,LiuT,WangQ,etal.PharmaceuticalBiotechnology,2009,16(3):250張貴鋒，劉濤，王前，等.藥物生物技術,2009,16(3):250HuJY,ChengXL,XiaoXY,etal.ChinesePharmaceuticalAffairs,2007,21(3):193胡軍影,程顯隆,肖新月，等.中國藥事,2007,21(3):193ZhangGF,LiuT,WangQ,etal.ChinaJournalofChineseMateriaMedica,2009,34(10)