甲霜靈膠體金競爭法試紙條的研制

北京萬華生物工程有限公司

2019.12.8

甲霜靈膠體金競爭法試紙條的研制1一、前言農藥甲霜靈簡介最高殘留限量標準檢測方法的建立分課題進展情況簡單匯報一、前言21.農藥甲霜靈簡介農藥甲霜靈（metalaxyl），又名阿普隆、雷多米爾、瑞毒霉、甲霜安，化學名稱D，L-N-（2，6-二甲基苯基）-N-（2‘-甲氧基乙基）氨基丙酸甲酯，屬酰苯胺類殺菌劑。

據中國農藥毒性分級標準，屬低毒殺菌劑。

對卵菌引起的病害具有獨特的保護和治療作用。1.農藥甲霜靈簡介農藥甲霜靈（metalaxyl），又名阿普32.最大殘留限量標準聯合國FAO/WHO食品法委員會（CCPR）《關于食品和飼料中農藥最高殘留限量的規定》中規定每日允許攝入量（ADI）為0.03mg/kg體重，禾谷類植物最高允許殘留量為0.05×10-6。中華人民共和國衛生部和中國國家標準化管理委員會于2019年1月25日發布，自2019年10月1日起實施中華人民共和國國家標準食品中農藥最大殘留限量標準（GB2763-2019），該標準中規定了農藥甲霜靈在食品中的最大允許殘留量。

2.最大殘留限量標準聯合國FAO/WHO食品法委員會（CCP4中華人民共和國國家標準甲霜靈在食品中最大殘留限量標準種類

最高殘留限量（MRL），≤，mg/kg國家標準號

谷子0.05GB2763-2019黃瓜0.5GB2763-2019葡萄1GB2763-2019中華人民共和國國家標準甲霜靈在食品中最大殘留限量標準種類最53.檢測方法建立甲霜靈不穩定，傳統的氣相色譜法檢測困難。Krause在原有檢測基礎上進行改進，將高效液相色譜法（HPLC）應用于食物樣本檢測中，此方法普遍用于檢測氨基甲酸酯類殺蟲劑。雖然HPLC法具有更高的靈敏度，可以精確地對樣品中的農藥進行定性和定量分析，但此法要求精密復雜的儀器，而且需要專業人員操作，不適合于大批量樣品的檢測。

3.檢測方法建立甲霜靈不穩定，傳統的氣相色譜法檢測困難。Kr6膠體金免疫層析診斷技術是在單克隆抗體技術、免疫層析技術及膠體金顯色技術基礎上發展起來的一項新型體外診斷技術，具有快速、靈敏、操作簡便、成本低、無需專業人員操作等特點，真正達到復雜原理與簡易操作的統一；同時具有保存方便，有效期長等特點。

與氣相色譜法補充使用，具有靈敏度高、操作簡便、檢測迅速等特點。膠體金免疫層析診斷技術是在單克隆抗體技術、免疫層析技術及膠體7主要技術路線主要技術路線84.分課題情況簡單匯報擬解決的關鍵技術：小分子免疫原的合成、與小分子免疫原抗原決定簇配對單克隆抗體的制備及膠體金研究。

4.分課題情況簡單匯報擬解決的關鍵技術：9課題完成情況及效果：本課題已成功研制出合成免疫原N2B，進行免疫獲得單克隆抗體N2B14E6C10,這一針對甲霜靈抗原決定簇配對的單克隆抗體，親和力好，效價達到10-9，并成功制成甲霜靈膠體金檢測試紙，應用競爭法膠體金檢測試紙最低檢出量可達0.3mg/kg，達到國標要求。通過比對試驗的驗證，相關系數r=0.99996，說明方法的可靠性。因此，可以肯定膠體金免疫法在農藥、獸藥殘留限量快速檢測技術中，是最有效、最快速、最簡便的方法。其優點在于靈敏度高、特異性強、操作簡便、快速、常溫儲存等，是適合于現場檢測的一種快速檢測方法，是食品安全檢測的一種手段，互補現有檢測方法各自的優缺點。

課題完成情況及效果：10二、試驗研究內容免疫原合成抗體制備膠體金研究半成品研制及鑒定成品研制二、試驗研究內容免疫原合成111.免疫原合成半抗原合成免疫原合成免疫原的鑒定小結1.免疫原合成12（1）半抗原合成將1.6gNaOH溶于200mL蒸餾水中，并加入10.056g甲霜靈，油浴50℃下攪拌6h，用TLC檢測，反應完全；用乙酸乙酯洗滌反應液，棄去酯相；水層用濃鹽酸調pH值至1.0左右，析出白色物質；用乙酸乙酯再次萃取混合液，酯相用無水硫酸鈉干燥過夜；抽濾酯相，旋轉蒸除溶劑，得到白色固體物質；用正己烷和乙酸乙酯重結晶，抽濾后得到半抗原N2（甲霜靈酸）。（1）半抗原合成將1.6gNaOH溶于200mL蒸餾水中，13（2）免疫原合成稱取0.265g甲霜靈酸，用8mLDMF溶解，加入0.258gDCC和0.125gNHS；用TLC監測反應完全程度，待反應完全后，抽濾反應液，用DMF洗滌兩遍；稱取2gBSA，用200mL0.2mol/LpH值8.7的硼酸鹽緩沖液溶解；將DMF溶液滴入到上述BSA溶液中，室溫攪拌過夜，得到甲霜靈免疫原N2B。

先用蒸餾水透析2天，再用生理鹽水透析3天，每天換液2次；透析后的溶液于3000r/min離心15min，取上清液于-20℃下冷凍干燥，凍干后分裝保存。同法可將甲霜靈酸連接到雞卵清蛋白OVA上，合成檢測原（N2A）。

（2）免疫原合成稱取0.265g甲霜靈酸，用8mLDMF溶14（3）免疫原的鑒定紫外掃描從紫外掃描圖譜可以看出：N2B在274.5nm出現最大吸收峰，峰值為0.209ABS；BSA在278.0nm出現最大吸收峰，峰值為0.083ABS。甲霜靈人工合成免疫原N2B在280nm左右的紫外吸收峰明顯高于BSA在280nm的紫外吸收峰，所以通過紫外掃描可以證明，甲霜靈半抗原成功的連接到了載體蛋白BSA上。（3）免疫原的鑒定紫外掃描從紫外掃描圖譜可以看出：N2B在215瓊脂糖雙擴散法鑒定DADT結果顯示，抗血清與免疫原（N2B）、BSA、檢測原（N2A）均出現反應沉淀線，而與OVA、甲霜靈未產生可見的沉淀線。這說明抗血清中含有甲霜靈抗體和BSA抗體，不與OVA交叉反應，雖然與甲霜靈發生交叉反應（理論上推測），但不形成可見的沉淀線。DADT檢測結果表明，N2B合成成功，即N2與BSA間通過化學鍵結合。瓊脂糖雙擴散法鑒定DADT結果顯示，抗血清與免疫原（N2B）16（4）小結本試驗通過化學合成法進行甲霜靈免疫原的制備，利用甲霜靈酸結構中的羧基，在適當的偶聯劑作用下將其連接到載體蛋白（-BSA）上，制成免疫原。通過紫外檢測法、動物免疫試驗對甲霜靈免疫原進行鑒定，證實免疫原合成成功。

（4）小結172.抗體制備單克隆抗體制備多克隆抗體制備2.抗體制備18（1）單克隆抗體制備單克隆抗體制備流程單克隆抗體特性鑒定小結（1）單克隆抗體制備19單克隆抗體制備流程單克隆抗體制備流程20用合成的免疫原N2B免疫BALB/C小鼠，在無菌條件下取免疫小鼠脾細胞與Sp2/0細胞融合，共融合6次，每次1只。用ELISA間接法從產生的267株陽性雜交瘤中，篩選出對甲霜靈抗原呈陽性反應的雜交瘤11株，注射小鼠185只，制備腹水419mL，純化得到275.8mg抗體。結果表明：我們成功獲得了能識別甲霜靈抗原決定簇的雜交瘤細胞株：N2B14E6C10。用合成的免疫原N2B免疫BALB/C小鼠，在無菌條件下取免疫21單克隆抗體鑒定①抗體的純度鑒定

從圖中可以看出N2B14E6C10在電泳中呈現1條帶，純度大于95%，同時這株抗體分子量與97.4KD蛋白標準品相近。

單克隆抗體鑒定①抗體的純度鑒定從圖中可以看出N2B1422②間接ELISA法檢測抗體活性

從左圖可以看出，當抗原濃度為0.32ng/mL時，OD450是1.681，大于0.5，因此活性合格。②間接ELISA法檢測抗體活性從左圖可以看出，當抗原濃度為23③間接ELISA法抗體特異性檢測

由左圖可以看出甲霜靈單抗只針對甲霜靈抗原特異，與其它無關抗原不發生反應，具有較好的特異性。

③間接ELISA法抗體特異性檢測由左圖可以看出甲霜靈單抗只24④抗體親和力的鑒定

④抗體親和力的鑒定25單抗測得三個Kaff值（M-1）Kaff值（M-1）均值±標準差變異系數（%）N2B14E6C107.41×109（6.72±0.507）×1097.50%6.20×1096.56×109N2B14E6C10抗體親和力表

測得三個Kaff值N2B14E6C107.41×109（26用甲霜靈抗原包被直接篩選，結果顯示：N2B14E6C10能識別甲霜靈抗原決定簇；經ProteinA柱直接純化，亞類為IgG1的這株抗體純度達到95%以上；抗體親和力常數（6.72±0.507）×109，可以滿足用于制備檢測試紙的檢測線。

小結小結27（2）多克隆抗體制備基本制備過程多克隆抗體活性鑒定小結（2）多克隆抗體制備28過程：動物免疫多克隆抗體純化多抗活性鑒定過程：動物免疫多克隆抗體純化多抗活性鑒定29500μg1000μg31.25μggg31.25μggggggg1000μg500μg62.5μg125μg250μg62.5μg125μg250μg0.5mg/mL1mg/mL從左圖可以看出，此羊抗屬IgG抗體稀釋濃度在31.25μg/mL時清晰可見沉淀線，判定此抗體活性合格。

多克隆抗體活性鑒定500μg1000μg31.25μg31.25μg1000μ30羊抗鼠多克隆抗體，經活性鑒定合格，可以滿足用于制備檢測試紙的控制線。小結小結313.膠體金研究經過電鏡結果分析（同甲萘威），我們可以得出：膠體金顆粒直徑在20～30nm之間時，顆粒大小均勻、無聚合與沉淀現象，且靈敏度高，為最佳狀態。此時與抗體的結合量為6～12mg，氯金酸與檸檬酸三鈉溶液的配比為30mL/18～20mL。3.膠體金研究經過電鏡結果分析（同甲萘威），我們可以得出：膠324.半成品研制及鑒定原理膠體金檢測試紙條的制作工藝流程半成品調試半成品鑒定小結4.半成品研制及鑒定原理33在硝酸纖維素膜上的檢測區包被甲霜靈合成免疫原，對照區包被羊抗鼠多克隆抗體。當待測物中有被測的抗原物質（即甲霜靈）時，待測物中的抗原物質就會與標記膠體金的甲霜靈單克隆抗體形成Ag-Ab-Au復合物，復合物不與包被在硝酸纖維素膜上的甲霜靈合成免疫原結合，僅會在控制線處出現一條色帶（C線），結果為陽性，說明被檢測的樣品中農藥甲霜靈超標。當待測物質中沒有被測的抗原物質時，標記膠體金的甲霜靈單克隆抗體就會與包被在硝酸纖維素膜上的甲霜靈合成免疫原結合，形成Ag-Ab-Au復合物，此時檢測線處可看到一條明顯色帶（T線），因此當檢測試紙上可看到兩條線（C線和T線）時，結果為陰性，說明被檢測的樣品中農藥甲霜靈未超標。原理在硝酸纖維素膜上的檢測區包被甲霜靈合成免疫原，對照區包被羊抗34膠體金檢測試紙條制作工藝流程膠體金檢測試紙條制作工藝流程35調試日期數量測試結果結果分析解決方法備注水標準品05.4.108條陰性無梯度，檢測1mg/mL和檢測水的顏色一樣。1.膠體金的濃度高2.膜的濃度高1.降低金的濃度2.降低膜的濃度檢測不同濃度的小樣8個05.4.118條陰性檢測限100μg/mL，敏感度低。1.膠體金的濃度高2.膜的濃度高1.降低金的濃度2.降低膜的濃度檢測不同濃度的小樣8個05.4.128條陰性檢測限1μg/mL，敏感度低。1.膠體金的濃度高2.膜的濃度高1.降低金的濃度2.降低膜的濃度檢測不同濃度的小樣8個05.4.138條無反應線

1.膠體金的濃度低2.膜的濃度低1.提高膠體金的濃度2.提高膜的濃度檢測不同濃度的小樣15個05.4.148條反應線淺檢測限10ng/mL1.膠體金的濃度低2.膜的濃度低1.提高膠體金的濃度2.提高膜的濃度檢測不同濃度的小樣10個05.4.178條陰性檢測限500ng/mL，敏感度低膠體金濃度高降低膠體金的濃度檢測不同濃度的小樣4個05.4.198條陰性檢測限300ng/mL。結果符合要求，測標準品有梯度。進行敏感性，特異性和陽性參考品檢測。生產試紙條進行半成品的鑒定05.4.198條陰性檢測陽性參考品達300ng/mL結果符合要求，測標準品有梯度。進行敏感性，特異性和陽性參考品檢測。生產試紙條進行半成品的鑒定05.4.198條陰性與其它農藥均無交叉結果符合要求，測標準品有梯度。進行敏感性，特異性和陽性參考品檢測。生產試紙條進行半成品的鑒定甲霜靈競爭法試紙條半成品靈敏度調試

05.4.108條陰性無梯度，檢測1mg/mL和檢測水的顏色36①

敏感性鑒定取甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標準品中，5分鐘內各試紙條均可見一條紅色的控制線，其中蒸餾水和濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的甲霜靈標準品在檢測區和控制區均可見一條色帶，為陰性；而濃度為300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標準品僅在控制區出現一條色帶，為陽性。

半成品鑒定①敏感性鑒定半成品鑒定37圖中試紙條從左到右依次是蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標準品的檢測結果。結果分析：

甲霜靈競爭法試紙條敏感度可達到300ng/mL；檢測標準品有梯度變化，靈敏度高，批間差小，性能穩定。

圖中試紙條從左到右依次是蒸餾水、濃度為10ng/mL、50n38②陽性參考品符合率鑒定取甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入濃度為300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜靈標準品中，5分鐘內各試紙條僅可見一條紅色的控制線，為陽性。②陽性參考品符合率鑒定39圖中試紙條從左到右依次是濃度為100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜靈標準品的檢測結果。

結果分析：甲霜靈競爭法試紙條性能穩定，特異性好。

圖中試紙條從左到右依次是濃度為100ng/mL、300ng/40③特異性鑒定取甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津樣品中，5分鐘內各試紙條在檢測區和控制區均可見一條色帶，為陰性。③特異性鑒定41圖中試紙條從左到右依次是濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津的檢測結果。

結果分析甲霜靈競爭法試紙條與濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津常用農藥均無交叉反應，特異性好。

圖中試紙條從左到右依次是濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲42④精密度鑒定取甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入300ng/mL的甲霜靈標準品中，同批次、不同批次各平行檢測10條，5分鐘內各試紙條均可見一條紅色的控制線，為陽性。甲霜靈膠體金競爭法試紙課件43每批試紙條是濃度為300ng/mL甲霜靈標準品的檢測結果。

結果分析：甲霜靈競爭法試紙性能穩定；可重復性好。

每批試紙條是濃度為300ng/mL甲霜靈標準品的檢測結果。44⑤穩定性鑒定膠體金檢測試紙條37℃放置20天穩定性試驗膠體金檢測試紙條4～30℃放置6個月穩定性試驗

⑤穩定性鑒定45膠體金檢測試紙條37℃放置20天穩定性試驗取甲霜靈競爭法試紙條保存在37℃放置20天，對產品每隔3天進行敏感性、陽性參考品符合率、特異性檢測。敏感性：取保存在37℃的甲霜靈競爭法試紙條依次浸在蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標準品中進行敏感性試驗，5分鐘內各試紙條均可見一條紅色的控制線，其中蒸餾水和濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的甲霜靈標準品在檢測區和控制區均可見色帶，為陰性；而濃度為300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標準品僅在控制區出現一條色帶，為陽性。膠體金檢測試紙條37℃放置20天穩定性試驗取甲霜靈競爭法試紙4637℃條件下甲霜靈競爭法試紙條敏感度檢測

日期（天）

批號0504240504280505100505170505250505283300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL6300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL9300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL12300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL15300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL18300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL21300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL3300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng47陽性參考品符合率：取保存在37℃的甲霜靈競爭法試紙條依次浸在濃度為300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜靈標準品中，進行陽性參考品符合率試驗；5分鐘內各試紙條僅可見一條紅色的控制線，為陽性。

甲霜靈膠體金競爭法試紙課件48日期（天）

批號0504240504280505100505170505250505283＋＋＋＋＋＋6＋＋＋＋＋＋9＋＋＋＋＋＋12＋＋＋＋＋＋15＋＋＋＋＋＋18＋＋＋＋＋＋21＋＋＋＋＋＋

37℃條件下甲霜靈競爭法試紙條陽性參考品檢測

37℃條件下甲霜靈競爭法試紙條陽性參考品檢測49特異性：取保存在37℃的甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津中進行特異性試驗，5分鐘內各批次試紙條在控制區和檢測區均可見一條色帶，為陰性。

特異性：取保存在37℃的甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入濃度均為50日期（天）

批號0504240504280505100505170505250505283－－－－－－6－－－－－－9－－－－－－12－－－－－－15－－－－－－18－－－－－－21－－－－－－37℃條件下甲霜靈競爭法試紙條特異性檢測050528－－37℃條件下甲霜靈競爭法試紙條特異性檢測51結果分析甲霜靈競爭法試紙條在37℃放置20天后，其敏感度仍可達到300ng/mL；批間差小，性能穩定；與100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津等農藥樣品均無交叉反應，特異性好。結果分析52膠體金檢測試紙條4～30℃放置6個月穩定性試驗將甲霜靈競爭法膠體金試紙條保存在4～30℃放置6個月，對產品每隔3個月進行敏感性、陽性參考品符合率、特異性檢測。

取保存在4～30℃的甲霜靈競爭法試紙條，依次浸在蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標準品中進行敏感性試驗，5分鐘內各試紙條均可見一條紅色的控制線，其中蒸餾水和濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的甲霜靈標準品在檢測區和控制區均可見色帶，為陰性；而甲霜靈標準品300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL僅在控制區出現一條色帶，為陽性。

膠體金檢測試紙條4～30℃放置6個月穩定性試驗將甲霜靈競爭法53取保存在4～30℃的甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入濃度為300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜靈標準品中進行陽性參考品符合率試驗，5分鐘內各試紙條僅可見一條紅色的控制線，為陽性。取保存在4～30℃的甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津中進行特異性試驗，5分鐘內各批次試紙條在控制區和檢測區均可見一條色帶，為陰性。

取保存在4～30℃的甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入濃度為30054批號

項目敏感性陽性參考品特異性050510300ng/mL＋，300ng/mL—050514300ng/mL＋，300ng/mL—050518300ng/mL＋，300ng/mL—4～30℃條件下放置3個月競爭法試紙條檢測4～30℃條件下放置3個月競爭法試紙條檢測55批號

項目敏感性陽性參考品特異性050510300ng/mL＋，300ng/mL—050514300ng/mL＋，300ng/mL—050518300ng/mL＋，300ng/mL—4～30℃條件下放置6個月競爭法試紙條檢測

4～30℃條件下放置6個月競爭法試紙條檢測56結果分析

甲霜靈競爭法試紙條在4～30℃放置6個月，其敏感度仍可達到300ng/mL；批間差小，性能穩定；與100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津等農藥均無交叉反應，特異性好。

結果分析57用國家農藥質檢中心標準品檢測，競爭法甲霜靈膠體金檢測試紙的最低檢出量不高于300ng/mL。采用陽性甲霜靈標準品，配制成濃度為100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL的甲霜靈樣品，結果濃度大于300ng/mL的甲霜靈陽性參考品為陽性，陽性符合率大于90%，性能穩定。小結用國家農藥質檢中心標準品檢測，競爭法甲霜靈膠體金檢測試紙的最58與100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津等農藥無交叉反應，特異性好。三批試紙條批內、批間檢測結果一致，具有良好的重現性和穩定性。通過對試紙條在37℃、20天和4～30℃、20個月的穩定性研究，因成品的有效期應比實際穩定存儲的期限少兩個月，結果確定該產品的有效期為18個月。回收率可達100%，膠體金檢測試紙條性能可靠，結果穩定。與100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆594.成品研制經過產品的包裝和質量標準的檢測，成功制成甲霜靈膠體金檢測試紙，應用競爭法膠體金檢測試紙最低檢出量可達0.3mg/kg，達到國標要求。4.成品研制60三、結論甲霜靈膠體金檢測試紙條是一種集快速、靈敏、操作簡便、價格低廉于一體的農藥殘留檢測產品，充分證實了膠體金免疫法在農藥、獸藥殘留檢測中是一種肯定、有效的快速檢測手段。

三、結論甲霜靈膠體金檢測試紙條是一種集快速、靈敏、操作簡便、61ThanksThanks62甲霜靈膠體金競爭法試紙課件63甲霜靈膠體金競爭法試紙條的研制

北京萬華生物工程有限公司

2019.12.8

甲霜靈膠體金競爭法試紙條的研制64一、前言農藥甲霜靈簡介最高殘留限量標準檢測方法的建立分課題進展情況簡單匯報一、前言651.農藥甲霜靈簡介農藥甲霜靈（metalaxyl），又名阿普隆、雷多米爾、瑞毒霉、甲霜安，化學名稱D，L-N-（2，6-二甲基苯基）-N-（2‘-甲氧基乙基）氨基丙酸甲酯，屬酰苯胺類殺菌劑。

據中國農藥毒性分級標準，屬低毒殺菌劑。

對卵菌引起的病害具有獨特的保護和治療作用。1.農藥甲霜靈簡介農藥甲霜靈（metalaxyl），又名阿普662.最大殘留限量標準聯合國FAO/WHO食品法委員會（CCPR）《關于食品和飼料中農藥最高殘留限量的規定》中規定每日允許攝入量（ADI）為0.03mg/kg體重，禾谷類植物最高允許殘留量為0.05×10-6。中華人民共和國衛生部和中國國家標準化管理委員會于2019年1月25日發布，自2019年10月1日起實施中華人民共和國國家標準食品中農藥最大殘留限量標準（GB2763-2019），該標準中規定了農藥甲霜靈在食品中的最大允許殘留量。

2.最大殘留限量標準聯合國FAO/WHO食品法委員會（CCP67中華人民共和國國家標準甲霜靈在食品中最大殘留限量標準種類

最高殘留限量（MRL），≤，mg/kg國家標準號

谷子0.05GB2763-2019黃瓜0.5GB2763-2019葡萄1GB2763-2019中華人民共和國國家標準甲霜靈在食品中最大殘留限量標準種類最683.檢測方法建立甲霜靈不穩定，傳統的氣相色譜法檢測困難。Krause在原有檢測基礎上進行改進，將高效液相色譜法（HPLC）應用于食物樣本檢測中，此方法普遍用于檢測氨基甲酸酯類殺蟲劑。雖然HPLC法具有更高的靈敏度，可以精確地對樣品中的農藥進行定性和定量分析，但此法要求精密復雜的儀器，而且需要專業人員操作，不適合于大批量樣品的檢測。

3.檢測方法建立甲霜靈不穩定，傳統的氣相色譜法檢測困難。Kr69膠體金免疫層析診斷技術是在單克隆抗體技術、免疫層析技術及膠體金顯色技術基礎上發展起來的一項新型體外診斷技術，具有快速、靈敏、操作簡便、成本低、無需專業人員操作等特點，真正達到復雜原理與簡易操作的統一；同時具有保存方便，有效期長等特點。

與氣相色譜法補充使用，具有靈敏度高、操作簡便、檢測迅速等特點。膠體金免疫層析診斷技術是在單克隆抗體技術、免疫層析技術及膠體70主要技術路線主要技術路線714.分課題情況簡單匯報擬解決的關鍵技術：小分子免疫原的合成、與小分子免疫原抗原決定簇配對單克隆抗體的制備及膠體金研究。

4.分課題情況簡單匯報擬解決的關鍵技術：72課題完成情況及效果：本課題已成功研制出合成免疫原N2B，進行免疫獲得單克隆抗體N2B14E6C10,這一針對甲霜靈抗原決定簇配對的單克隆抗體，親和力好，效價達到10-9，并成功制成甲霜靈膠體金檢測試紙，應用競爭法膠體金檢測試紙最低檢出量可達0.3mg/kg，達到國標要求。通過比對試驗的驗證，相關系數r=0.99996，說明方法的可靠性。因此，可以肯定膠體金免疫法在農藥、獸藥殘留限量快速檢測技術中，是最有效、最快速、最簡便的方法。其優點在于靈敏度高、特異性強、操作簡便、快速、常溫儲存等，是適合于現場檢測的一種快速檢測方法，是食品安全檢測的一種手段，互補現有檢測方法各自的優缺點。

課題完成情況及效果：73二、試驗研究內容免疫原合成抗體制備膠體金研究半成品研制及鑒定成品研制二、試驗研究內容免疫原合成741.免疫原合成半抗原合成免疫原合成免疫原的鑒定小結1.免疫原合成75（1）半抗原合成將1.6gNaOH溶于200mL蒸餾水中，并加入10.056g甲霜靈，油浴50℃下攪拌6h，用TLC檢測，反應完全；用乙酸乙酯洗滌反應液，棄去酯相；水層用濃鹽酸調pH值至1.0左右，析出白色物質；用乙酸乙酯再次萃取混合液，酯相用無水硫酸鈉干燥過夜；抽濾酯相，旋轉蒸除溶劑，得到白色固體物質；用正己烷和乙酸乙酯重結晶，抽濾后得到半抗原N2（甲霜靈酸）。（1）半抗原合成將1.6gNaOH溶于200mL蒸餾水中，76（2）免疫原合成稱取0.265g甲霜靈酸，用8mLDMF溶解，加入0.258gDCC和0.125gNHS；用TLC監測反應完全程度，待反應完全后，抽濾反應液，用DMF洗滌兩遍；稱取2gBSA，用200mL0.2mol/LpH值8.7的硼酸鹽緩沖液溶解；將DMF溶液滴入到上述BSA溶液中，室溫攪拌過夜，得到甲霜靈免疫原N2B。

先用蒸餾水透析2天，再用生理鹽水透析3天，每天換液2次；透析后的溶液于3000r/min離心15min，取上清液于-20℃下冷凍干燥，凍干后分裝保存。同法可將甲霜靈酸連接到雞卵清蛋白OVA上，合成檢測原（N2A）。

（2）免疫原合成稱取0.265g甲霜靈酸，用8mLDMF溶77（3）免疫原的鑒定紫外掃描從紫外掃描圖譜可以看出：N2B在274.5nm出現最大吸收峰，峰值為0.209ABS；BSA在278.0nm出現最大吸收峰，峰值為0.083ABS。甲霜靈人工合成免疫原N2B在280nm左右的紫外吸收峰明顯高于BSA在280nm的紫外吸收峰，所以通過紫外掃描可以證明，甲霜靈半抗原成功的連接到了載體蛋白BSA上。（3）免疫原的鑒定紫外掃描從紫外掃描圖譜可以看出：N2B在278瓊脂糖雙擴散法鑒定DADT結果顯示，抗血清與免疫原（N2B）、BSA、檢測原（N2A）均出現反應沉淀線，而與OVA、甲霜靈未產生可見的沉淀線。這說明抗血清中含有甲霜靈抗體和BSA抗體，不與OVA交叉反應，雖然與甲霜靈發生交叉反應（理論上推測），但不形成可見的沉淀線。DADT檢測結果表明，N2B合成成功，即N2與BSA間通過化學鍵結合。瓊脂糖雙擴散法鑒定DADT結果顯示，抗血清與免疫原（N2B）79（4）小結本試驗通過化學合成法進行甲霜靈免疫原的制備，利用甲霜靈酸結構中的羧基，在適當的偶聯劑作用下將其連接到載體蛋白（-BSA）上，制成免疫原。通過紫外檢測法、動物免疫試驗對甲霜靈免疫原進行鑒定，證實免疫原合成成功。

（4）小結802.抗體制備單克隆抗體制備多克隆抗體制備2.抗體制備81（1）單克隆抗體制備單克隆抗體制備流程單克隆抗體特性鑒定小結（1）單克隆抗體制備82單克隆抗體制備流程單克隆抗體制備流程83用合成的免疫原N2B免疫BALB/C小鼠，在無菌條件下取免疫小鼠脾細胞與Sp2/0細胞融合，共融合6次，每次1只。用ELISA間接法從產生的267株陽性雜交瘤中，篩選出對甲霜靈抗原呈陽性反應的雜交瘤11株，注射小鼠185只，制備腹水419mL，純化得到275.8mg抗體。結果表明：我們成功獲得了能識別甲霜靈抗原決定簇的雜交瘤細胞株：N2B14E6C10。用合成的免疫原N2B免疫BALB/C小鼠，在無菌條件下取免疫84單克隆抗體鑒定①抗體的純度鑒定

從圖中可以看出N2B14E6C10在電泳中呈現1條帶，純度大于95%，同時這株抗體分子量與97.4KD蛋白標準品相近。

單克隆抗體鑒定①抗體的純度鑒定從圖中可以看出N2B1485②間接ELISA法檢測抗體活性

從左圖可以看出，當抗原濃度為0.32ng/mL時，OD450是1.681，大于0.5，因此活性合格。②間接ELISA法檢測抗體活性從左圖可以看出，當抗原濃度為86③間接ELISA法抗體特異性檢測

由左圖可以看出甲霜靈單抗只針對甲霜靈抗原特異，與其它無關抗原不發生反應，具有較好的特異性。

③間接ELISA法抗體特異性檢測由左圖可以看出甲霜靈單抗只87④抗體親和力的鑒定

④抗體親和力的鑒定88單抗測得三個Kaff值（M-1）Kaff值（M-1）均值±標準差變異系數（%）N2B14E6C107.41×109（6.72±0.507）×1097.50%6.20×1096.56×109N2B14E6C10抗體親和力表

測得三個Kaff值N2B14E6C107.41×109（89用甲霜靈抗原包被直接篩選，結果顯示：N2B14E6C10能識別甲霜靈抗原決定簇；經ProteinA柱直接純化，亞類為IgG1的這株抗體純度達到95%以上；抗體親和力常數（6.72±0.507）×109，可以滿足用于制備檢測試紙的檢測線。

小結小結90（2）多克隆抗體制備基本制備過程多克隆抗體活性鑒定小結（2）多克隆抗體制備91過程：動物免疫多克隆抗體純化多抗活性鑒定過程：動物免疫多克隆抗體純化多抗活性鑒定92500μg1000μg31.25μggg31.25μggggggg1000μg500μg62.5μg125μg250μg62.5μg125μg250μg0.5mg/mL1mg/mL從左圖可以看出，此羊抗屬IgG抗體稀釋濃度在31.25μg/mL時清晰可見沉淀線，判定此抗體活性合格。

多克隆抗體活性鑒定500μg1000μg31.25μg31.25μg1000μ93羊抗鼠多克隆抗體，經活性鑒定合格，可以滿足用于制備檢測試紙的控制線。小結小結943.膠體金研究經過電鏡結果分析（同甲萘威），我們可以得出：膠體金顆粒直徑在20～30nm之間時，顆粒大小均勻、無聚合與沉淀現象，且靈敏度高，為最佳狀態。此時與抗體的結合量為6～12mg，氯金酸與檸檬酸三鈉溶液的配比為30mL/18～20mL。3.膠體金研究經過電鏡結果分析（同甲萘威），我們可以得出：膠954.半成品研制及鑒定原理膠體金檢測試紙條的制作工藝流程半成品調試半成品鑒定小結4.半成品研制及鑒定原理96在硝酸纖維素膜上的檢測區包被甲霜靈合成免疫原，對照區包被羊抗鼠多克隆抗體。當待測物中有被測的抗原物質（即甲霜靈）時，待測物中的抗原物質就會與標記膠體金的甲霜靈單克隆抗體形成Ag-Ab-Au復合物，復合物不與包被在硝酸纖維素膜上的甲霜靈合成免疫原結合，僅會在控制線處出現一條色帶（C線），結果為陽性，說明被檢測的樣品中農藥甲霜靈超標。當待測物質中沒有被測的抗原物質時，標記膠體金的甲霜靈單克隆抗體就會與包被在硝酸纖維素膜上的甲霜靈合成免疫原結合，形成Ag-Ab-Au復合物，此時檢測線處可看到一條明顯色帶（T線），因此當檢測試紙上可看到兩條線（C線和T線）時，結果為陰性，說明被檢測的樣品中農藥甲霜靈未超標。原理在硝酸纖維素膜上的檢測區包被甲霜靈合成免疫原，對照區包被羊抗97膠體金檢測試紙條制作工藝流程膠體金檢測試紙條制作工藝流程98調試日期數量測試結果結果分析解決方法備注水標準品05.4.108條陰性無梯度，檢測1mg/mL和檢測水的顏色一樣。1.膠體金的濃度高2.膜的濃度高1.降低金的濃度2.降低膜的濃度檢測不同濃度的小樣8個05.4.118條陰性檢測限100μg/mL，敏感度低。1.膠體金的濃度高2.膜的濃度高1.降低金的濃度2.降低膜的濃度檢測不同濃度的小樣8個05.4.128條陰性檢測限1μg/mL，敏感度低。1.膠體金的濃度高2.膜的濃度高1.降低金的濃度2.降低膜的濃度檢測不同濃度的小樣8個05.4.138條無反應線

1.膠體金的濃度低2.膜的濃度低1.提高膠體金的濃度2.提高膜的濃度檢測不同濃度的小樣15個05.4.148條反應線淺檢測限10ng/mL1.膠體金的濃度低2.膜的濃度低1.提高膠體金的濃度2.提高膜的濃度檢測不同濃度的小樣10個05.4.178條陰性檢測限500ng/mL，敏感度低膠體金濃度高降低膠體金的濃度檢測不同濃度的小樣4個05.4.198條陰性檢測限300ng/mL。結果符合要求，測標準品有梯度。進行敏感性，特異性和陽性參考品檢測。生產試紙條進行半成品的鑒定05.4.198條陰性檢測陽性參考品達300ng/mL結果符合要求，測標準品有梯度。進行敏感性，特異性和陽性參考品檢測。生產試紙條進行半成品的鑒定05.4.198條陰性與其它農藥均無交叉結果符合要求，測標準品有梯度。進行敏感性，特異性和陽性參考品檢測。生產試紙條進行半成品的鑒定甲霜靈競爭法試紙條半成品靈敏度調試

05.4.108條陰性無梯度，檢測1mg/mL和檢測水的顏色99①

敏感性鑒定取甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標準品中，5分鐘內各試紙條均可見一條紅色的控制線，其中蒸餾水和濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的甲霜靈標準品在檢測區和控制區均可見一條色帶，為陰性；而濃度為300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標準品僅在控制區出現一條色帶，為陽性。

半成品鑒定①敏感性鑒定半成品鑒定100圖中試紙條從左到右依次是蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標準品的檢測結果。結果分析：

甲霜靈競爭法試紙條敏感度可達到300ng/mL；檢測標準品有梯度變化，靈敏度高，批間差小，性能穩定。

圖中試紙條從左到右依次是蒸餾水、濃度為10ng/mL、50n101②陽性參考品符合率鑒定取甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入濃度為300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜靈標準品中，5分鐘內各試紙條僅可見一條紅色的控制線，為陽性。②陽性參考品符合率鑒定102圖中試紙條從左到右依次是濃度為100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜靈標準品的檢測結果。

結果分析：甲霜靈競爭法試紙條性能穩定，特異性好。

圖中試紙條從左到右依次是濃度為100ng/mL、300ng/103③特異性鑒定取甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津樣品中，5分鐘內各試紙條在檢測區和控制區均可見一條色帶，為陰性。③特異性鑒定104圖中試紙條從左到右依次是濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津的檢測結果。

結果分析甲霜靈競爭法試紙條與濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津常用農藥均無交叉反應，特異性好。

圖中試紙條從左到右依次是濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲105④精密度鑒定取甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入300ng/mL的甲霜靈標準品中，同批次、不同批次各平行檢測10條，5分鐘內各試紙條均可見一條紅色的控制線，為陽性。甲霜靈膠體金競爭法試紙課件106每批試紙條是濃度為300ng/mL甲霜靈標準品的檢測結果。

結果分析：甲霜靈競爭法試紙性能穩定；可重復性好。

每批試紙條是濃度為300ng/mL甲霜靈標準品的檢測結果。107⑤穩定性鑒定膠體金檢測試紙條37℃放置20天穩定性試驗膠體金檢測試紙條4～30℃放置6個月穩定性試驗

⑤穩定性鑒定108膠體金檢測試紙條37℃放置20天穩定性試驗取甲霜靈競爭法試紙條保存在37℃放置20天，對產品每隔3天進行敏感性、陽性參考品符合率、特異性檢測。敏感性：取保存在37℃的甲霜靈競爭法試紙條依次浸在蒸餾水、濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標準品中進行敏感性試驗，5分鐘內各試紙條均可見一條紅色的控制線，其中蒸餾水和濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的甲霜靈標準品在檢測區和控制區均可見色帶，為陰性；而濃度為300ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL甲霜靈標準品僅在控制區出現一條色帶，為陽性。膠體金檢測試紙條37℃放置20天穩定性試驗取甲霜靈競爭法試紙10937℃條件下甲霜靈競爭法試紙條敏感度檢測

日期（天）

批號0504240504280505100505170505250505283300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL6300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL9300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL12300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL15300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL18300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL21300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng/mL3300ng/mL300ng/mL300ng/mL300ng110陽性參考品符合率：取保存在37℃的甲霜靈競爭法試紙條依次浸在濃度為300ng/mL、500ng/mL、800ng/mL、1μg/mL甲霜靈標準品中，進行陽性參考品符合率試驗；5分鐘內各試紙條僅可見一條紅色的控制線，為陽性。

甲霜靈膠體金競爭法試紙課件111日期（天）

批號0504240504280505100505170505250505283＋＋＋＋＋＋6＋＋＋＋＋＋9＋＋＋＋＋＋12＋＋＋＋＋＋15＋＋＋＋＋＋18＋＋＋＋＋＋21＋＋＋＋＋＋

37℃條件下甲霜靈競爭法試紙條陽性參考品檢測

37℃條件下甲霜靈競爭法試紙條陽性參考品檢測112特異性：取保存在37℃的甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入濃度均為100μg/mL的草甘磷、甲基立枯磷、敵百蟲、林丹、綠麥隆、甲基對硫磷、禾草靈、乙草胺、甲草胺、甲胺磷、、甲萘威、毒死蜱、百菌清、莠去津中進行特異性試驗，5分鐘內各批次試紙條在控制區和檢測區均可見一條色帶，為陰性。

特異性：取保存在37℃的甲霜靈競爭法試紙條，依次浸入濃度均為113日期（天）

批號0504240504280505100505170505250505283－－－－－－6－－－－－－9－－－－－－12－－－－－－15－－－－－－18－－