T/CSMAXXXX－2018大苞閉鞘姜種子超低溫保存技術規程范圍本標準規定了大苞閉鞘姜[CostusmegalobracteaK.Schum.]種子超低溫保存過程中的術語和定義、種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復培養等技術要求。本標準適用于大苞閉鞘姜種子的超低溫長期貯藏。規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.6農作物種子檢驗規程水分測定GB/T3543.7農作物種子檢驗規程其他項目檢驗術語和定義下列術語和定義適用于本文件。大苞閉鞘姜CostusmegalobracteaK.Schum.為姜科（Zingiberaceae）閉鞘姜屬（CostusL.）草本植物，有消炎利尿，散瘀消腫的功效。閉鞘姜屬植物不僅具有藥用和食用價值，還可作切花，盆花觀賞。收載于《世界藥用植物速查辭典（2015）》。大苞閉鞘姜果實CostusmegalobracteaK.Schum.fruits果實為蒴果，稍木質，長1.3cm，紅色，圓形或卵圓形。室背開裂，頂端冠以宿存的花萼。大苞閉鞘姜種子CostusmegalobracteaK.Schum.seeds大苞閉鞘姜的播種材料為完整種子，貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子黑色，光亮，多數，具白色撕裂狀假種皮。種子超低溫保存seedofcryopreservation指將經過前處理的大苞閉鞘姜種子置于液氮（-196℃）中保存。種子的選擇果實采收當果皮顏色變為紅色，即可采收，去除種子外假種皮，取出種子。種子選擇挑選發育飽滿、均勻、健康的種子，置于4℃冰箱中保存備用（存放時間不超過2個月）。種子前處理生活力檢測參照《植物生理學實驗指導》中的溴麝香草酚藍（BTB）法測定種子生活力。待測種子在30℃~35℃溫水中浸種2h，隨后取吸脹種子50粒，整齊地埋于備好的瓊脂凝膠中，注意要將含胚部分埋入凝膠中。將培養皿置于35℃溫箱中10h后觀察結果。生活力計算在光下用放大鏡對染色結果進行觀察鑒定。凡種胚周圍出現黃色暈圈的種子為有活力的種子，否則為無活力的種子。計算：生活力=有活力的種子數/總的種子數×100%待保存的大苞閉鞘姜種子生活力應≥65%。含水量范圍用尼龍網袋包裹大苞閉鞘姜種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內，硅膠與種子的體積比為210000:1，室溫條件下干燥處理0~10h，在干燥過程中定期測定種子含水量，將種子含水量由15%~20%降至13%~15%。參照GB/T3543.6中的高恒溫烘干法（130℃烘干1h）測定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。種子保存量大苞閉鞘姜種子保存量不少于500粒，以便后期的活力檢測使用。種子冷凍方式大苞閉鞘姜種子超低溫保存的冷凍方式為玻璃化冷凍法，即將裝有種子的1mL凍存管（每管50粒種子）置于裝載液（LS）中并于25℃處理種子20min，再用玻璃化保護溶液（PVS2）冰浴處理種子30min，換上預冷新鮮的PVS2后迅速投入液氮中進行超低溫保存。恢復培養種子解凍處理液氮中至少凍存24h后，取出1個凍存管，立即放入40℃水浴中快速解凍2min，而后用洗滌液（DS）浸泡15min，并用純凈水洗滌3次。凍后種子生活力檢測取出25粒解凍后的種子，參照5.1~5.2生活力檢測方法，進行超低溫保存后的初始生活力檢測。當種子生活力≥50%時視為保存成功。恢復培養將剩下25粒解凍后的大苞閉鞘姜種子，播種到帶有無菌濾紙的帶蓋發芽盒中，溫度25℃~30℃，濕度70%~85%條件下培養。附錄[1]BTB的配制和保存方法精密稱取BTB0.5g，溶解于煮沸過的500Ml純水中。濾液若呈黃色，可加數滴氫氧化鈉溶液，使之變為藍色或藍綠色，隨后加入3.5g瓊脂溶解，稍稍冷卻即可趁熱倒入9cm培養皿中，使之成一均勻的薄層，完全冷卻后備用。[2]裝載液（LS）的配制及保存方法精密稱取蔗糖13.7g，稱量甘油11.9mL，溶于液體MS培養基中，調pH至5.8，并定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。[3]玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法精密量取甘油23.8mL、乙二醇13.6mL、二甲亞砜13.6mL，稱取蔗糖13.7g，溶于MS溶液中，調pH至5.8后定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。注意：配置時需戴手套，并在通風廚內操作。[4]洗滌液（DS）的配制及保存方法精密稱取蔗糖41.1g溶于MS溶液中，調pH至5.8后定容至100mL，高溫高壓滅菌，4℃冷藏。參考文獻[1]肖培根，劉昌孝，江紀武等.世界藥用植物速查辭典[M].中國醫藥科技出版社.2015[2]中國科學院中國植物志委員會.中國植物志[M].科學出版社，2004（1981），16（2）：149.[3]傅