名稱：生物樣品的采集及實驗動物的解剖和臟器系數測定標準操作規程(SOP)

關鍵詞：生物樣品的采集實驗動物解剖臟器系數測定

目的：在藥物毒理學研究中，常常需要收集實驗動物的血液、尿液或其它體液進行常規檢查或生化分析，因此，正確采集實驗動物的生物材料是藥物毒理學最基本和最重要的操作技術。對實驗動物進行大體解剖檢查是藥物毒理實驗的常規觀察項目，簡便易行并能提供重要資料。測定動物死后器官濕重和含水量是常用的指標之一，可以從大體標本大概地估計內臟器官病變的程度，特別適用于某些可致內臟水腫、實質細胞腫脹、間質纖維組織增生或臟器萎縮等藥物的研究。組織勻漿的制備以及在勻漿技術的基礎上發展起來的亞細胞結構分離技術，也是藥物毒理實驗的重要技術之一。學習和掌握藥物毒理學試驗中常用的生物材料的采集方法；實驗動物的處死方法、大體解剖檢查、臟器系數和含水量的測定以及組織勻漿的制備；了解病理切片常規收集樣本的部位和方法。

主體內容

（一）血液的采集

1、大鼠與小鼠的采血方法：

①鼠尾采血：當所需血量很少時采用本法。固定動物并露出鼠尾，將尾部浸入45~50℃溫水中數分鐘，使尾靜脈充血，擦干，再用酒精棉球擦試消毒。剪掉尾尖（約0.2~0.3cm），拭去第一滴血。然后用血色素吸管定量吸取尾血，或將尾血直接滴入容器內。采血完畢用干棉球壓迫止血。亦可不剪尾，用7~8號注射針頭連上注射器直接刺破尾靜脈采血。

②眼眶靜脈叢采血：當需用中等量的血液，而又避免動物死亡時采用本法。左手拇指及食指緊緊握住大鼠或小鼠頸部，壓迫頸部兩側使眶后靜脈叢充血，但用力要恰當，防止動物窒息死亡。右手持玻璃毛細管從右眼或左眼內眥部以45°角刺入，刺入深度小鼠約2～3mm,大鼠4～5mm。若遇阻力稍后退調整角度后再刺入，如穿刺適當，血液能自然流入毛細管內。得到所需的血量后，即除去加于頸部的壓力，拔出毛細管，用干棉球壓迫止血。

③斷頭采血：當需用較大量的血液，而又不需繼續保存動物生命時采用本法。左手握住動物，右手持剪刀，快速剪掉頭頸部，倒立動物讓血液滴入容器。需注意防止斷毛落入容器中。

2、家兔采血方法：

①耳緣靜脈采血：本法為最常用的取血方法之一，可多次反復取血。將家兔固定于兔箱中，拔掉擬采血耳緣部細毛，用手指輕輕彈耳或電燈照射兔耳，使耳部血管擴張，然后消毒。左手壓迫耳根，用針頭刺破靜脈或以刀片在血管上切一小口，讓血液自然流出。也可直接用注射器進針耳緣靜脈抽取血液。采血完畢用干棉球壓迫止血，如一時不易止血，可用木夾夾住耳殼10~20分鐘。

②心臟穿刺采血：將家兔仰臥位固定在兔臺上或由助手捉持，在左胸第2~4肋部剪毛，常規消毒。于第3~4肋胸骨左緣心跳最明顯處穿刺，針頭刺入心臟后即見血液涌入注射器。采血完畢迅速將針頭拔出，這樣心肌上的穿刺孔較易閉合，針眼處用酒精棉球壓迫止血。體重2公斤的家兔每隔2~3周可重復采血10~20ml。

③股動脈采血：將家兔仰臥固定在兔臺上，左手拉直動物后肢，右手持注射器，以血管博動為指標，將針頭刺入股動脈。若已刺入動脈，即有鮮紅色血液流入注射器。抽血完畢迅速拔出針頭，用干棉球壓迫止血。

3、狗的采血方法：

①后肢外側小隱靜脈和前肢皮下頭靜脈采血：本法最常用，且方便。后肢外側小隱靜脈位于后肢脛部下1/3的外側淺表的皮下，由前側走向后上側，前肢皮下頭靜脈位于前肢腳爪上方背側的正前方。抽血前，將狗固定在狗臺上或使狗側臥，由助手固定好。剪去抽血部位的毛，常規消毒。一人用力壓迫靜脈近心端或用止血帶綁緊，使靜脈充盈，另一人持注射器進行靜脈穿刺。取得所需血量后拔出針頭，以干棉球壓迫止血。

②耳緣靜脈采血：當需少量血液或作血常規檢查時，可用狗的耳緣靜脈采血法。剪毛后先將狗的耳殼加熱，或用二甲苯棉球擦耳殼，然后以刀片切割已擴張的血管，使血液滴入容器。采血完畢，以干棉球壓迫切割口以止血。

4、采集血液的注意點：

①實驗動物一次采血量過多或采血過于頻繁，都可影響動物健康，造成貧血甚至

死亡，其最大安全采血量見表1。

②采血方法的選擇，主要取決于實驗的目的和所需血量的多少，所需血量較少時可刺

破組織取毛細血管的血，當需血量較多時可作靜脈采血，若需反復多次靜脈采血時，應自遠心端開始。

③若需抗凝全血，在注射器或試管內需預先加入抗凝劑，常用的抗凝劑有：

A、草酸鉀：常用于供檢驗用血液樣品的抗凝。在試管內加飽和草酸鉀溶液2滴，均勻浸濕管壁后，放入烘箱（80℃）烤干，包好備用。每管能使3~5ml血液不凝固，供鉀、鈣含量測定的血樣不能用草酸鉀抗凝。

B、肝素：取1%肝素溶液0.1ml于試管內，均勻浸濕試管內壁，放入烘箱（80~100℃）中烤干。每管能使5~10ml血液不凝固。市售的肝素注射液每ml含肝素12.500U，相當于肝素鈉125mg。

C、枸櫞酸鈉：3.8%的枸櫞酸鈉溶液1份可使9份血液不凝固，用于紅細胞沉降速率測定。因其抗凝作用較弱而堿性較強，不適用于供化驗用的血液樣品。

（二）尿液的收集

1、一次尿收集法：在實驗研究中，有時為了某種實驗目的，要求每間隔一定的時間收集一次尿液，如每4小時收集一次，以觀察藥物的排泄情況。此種情況下，常用以下方法收集尿液。

①逼尿法：本法適用于兔、貓。助手把動物抱住，操作者右手由腹腔向下逐漸用力壓迫膀胱，逼出尿液。

②導尿法：本法適用于兔、貓、猴和狗等動物，是較常用的方法之一。動物取仰臥位固定于手術臺上，尿道口常規消毒。以左手充分暴露尿道口且固定之，右手持導尿管（尖端涂有消毒凡士林或液體石蠟）順尿道輕而慢地插入，家兔插入約8~12cm，一旦進入膀胱腔，即見尿液流出。若無尿流出，可將導尿管適當上下左右移動，到尿液流出為止，然后用膠布將導尿管與動物體固定。

③輸尿管插管法：本法適用于兔、貓、猴和狗。以兔為例：將兔麻醉后仰臥位固定在手術臺上，于恥骨聯合上緣沿正中腹白線作一4~6cm的切口，打開腹腔，在膀胱底兩側找出左右兩根輸尿管，分離后于兩根輸尿管下各穿兩根線，一根結扎近膀胱端，在結扎線上方向腎臟方向剪一小口插入導管，用另一線結扎。將兩根導管的游離端一并放入量筒內收集尿液。實驗過程中，應用溫生理鹽水紗布覆蓋手術野，以保持腹腔溫度。

2、連續收集尿液的方法

大鼠和小鼠的留尿法：在小動物的毒理實驗中，常常收集24小時或某特定時間內的尿液。為此常用代謝籠配上糞尿分離漏斗收集尿液，此裝置除支架外均用玻璃或有機玻璃制成，便于清洗。該裝置主要包括圓形有機玻璃籠罩，帶孔的圓玻璃底盤，供飲水和食料的裝置，錐形集尿漏斗和糞尿分離器等。動物置于代謝籠內，糞尿分離漏斗的側口接一只150~200ml的集尿容器收集尿液。

一般5~6小時內，平均每只小鼠可收集到0.4~0.5ml的尿液。如留尿前給予灌胃，每克體重灌液0.02ml，則可增至0.7~0.8ml。未經水負荷的正常大鼠，排尿量約為0.5ml/100g體重/小時。

貓和兔連續集尿裝置的組成部分與大鼠的基本相同。但代謝籠常用鐵絲和搪瓷制成。集尿的容器要大一些。

3、收集尿液的注意點

①尿液收集器必須保證糞尿分開，防止糞便污染尿液。標本容器務須潔凈，其容量視動物而定。

②標本收集后，須在新鮮時進行檢驗，若需放置時間較久，則須貯放在冰箱或加入適當的防腐劑。

③分析尿中金屬離子時，代謝籠等應避免用金屬材料制成，集尿容器最好用聚乙烯材料的。

④為了滿足實驗所需尿量，在收集尿液前，可灌喂適量的水及青菜。

（三）其它體液的采集

1、精液的采集：研究藥物對雄性動物生殖系統的作用時，精液的觀察甚為重要。常用的采集精液的方法有人工陰道法、按摩法、電刺激法及麻醉法等。實驗小動物如大、小鼠，也可以采集雌鼠陰道內的陰栓來檢查精液凝固后的情況。鼠于交配后，精液在陰道內凝固，如一白色栓塞堵在陰道中，叫做陰栓。小鼠的陰栓比較牢固，可在陰道內存留1~2天；大鼠的陰栓不牢固，容易脫落。所以，檢查大鼠的陰栓時，除檢查陰道外，還應在籠底尋找陰栓。出現陰栓說明已經交配。

狗的精液采集可用簡便的辦法：將雄狗帶到發情雌狗的狗舍（雌狗一年內二次發情期，經常在1~2月和6~8月，每次可持續20~25天），因雌狗在發情期，外生殖器官紅腫并分泌很多特殊血性分泌物，當雄狗接近發情雌狗嗅到這種分泌物時，可引起雄狗發情。此時立即將雄狗拉上狗臺，在雄狗已勃起的陰莖根部輕輕壓迫，即可引起雄狗射精。三種常用實驗動物精液正常值如表2。

2、唾液的采集：一般可引用食餌誘使唾液分泌，再從口腔內采集。另外，還可用唾液腺導管引出法，分離出腮腺（或頜下腺與舌下腺）唾液導管，插入細塑料管，采集唾液。

3、胃液的采集：將胃管經動物口腔插入胃內，在胃管的出口端連接注射器吸取胃液。一般在禁食6小時后抽取。

（四）實驗動物的處死方法

1、大鼠和小鼠的處死方法：

①脊椎脫臼法：右手抓住鼠尾用力向后拉，同時左手拇指與食指用力向下按住鼠頭。將脊髓與腦髓拉斷，鼠便立刻死亡，這是小鼠最常用的處死方法。

②斷頭法：用剪刀在鼠頸部將鼠頭剪掉，迅速將鼠身倒置放血，由于剪斷腦脊髓和大量失血，會很快死亡。但易引起肺淤血，因此，重點觀察肺部病變的實驗，不宜采用此法。

③擊打法；右手抓住鼠尾，提起，用力摔擊其頭部，鼠痙攣后立即死亡。或用小木錘用力擊打鼠頭部也可致死。

④急性失血法：可采用鼠眼眶動脈和靜脈急性大量失血方法使鼠立即死亡。左手拇指和食指盡量將鼠頭部皮膚捏緊，使鼠眼球突出。右手持彎頭小鑷，在鼠右側眼球根部將眼球摘去，并將鼠倒置，頭向下，此時血液很快從眼眶內流出。

⑤化學致死法：吸入CO，大、小鼠在CO濃度為0.2~0.5%環境中即可致死。

另外，皮下注射士的寧（小鼠0.76~2.0mg/kg，大鼠3.0~3.5mg/kg），吸入乙醚、氯仿均可致死。

2、家兔和狗的處死方法：

①空氣栓塞法：向動物靜脈內注入一定量的空氣，使動物發生空氣栓塞，形成嚴重的血液循環障礙而死亡。一般家兔注入20~40ml空氣，狗注入80~150ml空氣即可致死。本法優點是處死方法簡單、迅速，缺點是由于動物死于急性循環，各臟器淤血十分明顯。

②急性失血法；先使動物麻醉，暴露股三角區或腹腔，再切斷股動脈或腹主動脈，立即噴出血液。用一塊濕紗布不斷擦去切口周圍處的血液和血凝塊，同時不斷地用自來水沖洗流血，使切口處保持通暢，動物在3~5分鐘內即可死亡。采用本法動物十分安靜，對臟器無損害，但器官貧血比較明顯，是目前活殺采集病理標本較好的方法。

另外，對家兔也可用木錘用力錘擊其后腦部，損壞延腦，造成死亡。也可注入一定量的化學藥物，如氰化鉀溶液、福爾馬林溶液、士的寧等造成死亡。

（五）實驗動物的剖檢方法

動物尸體取仰臥位，將四肢固定，用水浸濕被毛。從下頜中央開始到恥骨聯合正中垂直切口，用骨剪把左右肋骨剪斷后，將胸骨向前下方翻開，即可暴露胸、腹腔。按胸腔、腹腔、顱腔的次序觀察各臟器位置、形狀及彼此相互關系，然后分別取下。先在胸腔入口處切斷食道和氣管，將心和肺一起取出。再依次摘除腹部臟器脾、肝、腎上腺、腎、胃、腸和盆腔器官，分別進行各臟器的檢查。

在解剖和取材時，應盡量減少由于器械或手術粗暴引起的機械損傷。刀、剪要鋒利，鑷子應盡量鑷在不重要的部位，以減少人為損傷。

1、呼吸器官：先檢查喉頭、聲門粘膜有無出血和水腫，兩側肺表面有無出血、感染、肺實變或肺氣腫現象。再剪開氣管、支氣管及其分支，檢查粘膜有無充血、出血、感染情況，有無泡沫樣炎性滲出液、肺的切面有無實質性病灶、氣腫、萎縮、出血等病變。

2、心臟：剪開心包膜，暴露出心臟，注意心臟的大小、外形和心外膜情況。自下腔靜脈入口處將右心房作直線剖開，然后從此線的中點沿心臟右緣剖至心尖部，再從心尖部在心室膈右側沿冠狀動脈溝平行地剖至肺動脈，觀察右心的心肌、心內膜、三尖瓣和肺動脈瓣有無病變。自左右肺靜脈入口處將左心房直線剪開，沿心臟左緣剖至心尖部，再從心尖部在心室膈左側向上剖開左心室的前壁到主動脈，觀察左心的心肌、心內膜、二尖瓣和主動脈瓣有無病變。

3、肝臟：觀察肝臟的形狀和色澤，包膜有無增厚粘連，肝實質有無充血、出血、淤血和脂肪變，切面肝小葉的結構是否清晰，門靜脈、膽管和血管有無擴張等。切開膽囊（大鼠無膽囊），檢查膽囊充盈程度、膽汁性狀（顏色、透明度、濃度）和粘膜的形態。

4、脾臟：觀察脾臟的形態、質地（堅硬、柔軟、脆弱）、體積大小和色澤、包膜表面是否平滑或有皺紋，切面濾泡、小梁和紅髓的結構，正常動物這三種結構清晰可見。

5、腎臟：注意腎臟外形、大小、軟硬度，包膜有無粘連、腎表面有無凹凸不平等。自腎凸面對準腎門作一縱切面，切面應使腎盂對半剖開，檢查皮質和髓質的界限、顏色、斑點等。腎盞和腎盂有無充血、出血、異常內容物的積聚。根據實驗需要，亦可以一并剪開輸尿管、膀胱進行檢查。

6、胃腸道：從食道下端沿胃大彎從賁門經胃底剪到幽門，注意胃內容物、胃粘膜顏色，有無增厚、出血、潰瘍和瘢痕。檢查各段腸道漿膜，腸系膜及其淋巴結的情況，拉開腸系膜觀察有無寄生蟲感染。

7、生殖器官：剪開睪丸鞘膜檢查鞘膜及腔內液體后，將睪丸、附睪一起切開，觀察睪丸、附睪有無病變。雌性動物應檢查卵巢、輸卵管及子宮等有無病變。

8、腦和脊髓：打開顱腔（小動物只需要普通家用剪刀及小骨鉗，大動物則需要弓形鋸），先觀察硬腦（脊）膜有無充血、出血、滲出等異常變化。然后從正中剪開硬腦（脊）膜，檢查腦實質各部分有無異常變化。

（六）臟器系數和臟器含水量的測定

臟器系數指內臟器官重量與體重(kg或100g)的比值，含水量（g）指器官濕重與干重之差。其方法是動物在麻醉下用急性失血法處死，按上述剖檢的順序依次摘取所需臟器，用生理鹽水稍加漂洗后吸干臟器表面水份，立即在感量為百分之一克天平上稱重，稱得的重量除以體重即得各臟器系數。測定含水量的部分，放在恒重的器皿中，準確稱其濕重后，將組織盡量剪碎，在105℃烘箱中烘烤2小時后，稱其重量，再用同法烘烤，直至恒重，然后計算干、濕重差即得各臟器含水量。

（七）動物解剖后組織標本的選取

藥物毒性實驗中，動物剖檢除大體觀察外，要求各臟器必須制作病理切片，在顯微鏡下觀察其細微變化。因此，對動物尸體解剖的同時，應選取組織塊，供制片檢查。常規采取組織的部位及塊數如下：

心臟：1~2塊，即左室前壁連同乳頭肌1塊，右室