關于動物干細胞技術簡介第一頁，共七十五頁，2022年，8月28日第一節干細胞簡介干細胞的定義自我更新和分化潛能的細胞,在細胞發育過程中處于較原始階段.干細胞的分類干細胞有兩方面區別于其它細胞的特征：

1，可分化為與自身完全相同的細胞，2，可生產出特異性分化的細胞。

根據個體發育過程中出現的先后次序不同，干細胞可分為兩類：胚胎干細胞及成體干細胞。第二頁，共七十五頁，2022年，8月28日1.帶間充質干細胞：大量存在于臍帶組織中，具有胚胎干細胞類似的增殖能力和多向分化潛能，來源豐富、取材方便、無道德倫理爭議，可獲取的細胞數量多、活力強，療效顯著，可以擴增和傳代，同時又沒有配型、排斥等問題，不但能夠成為骨髓間充質干細胞的理想替代物，也是最具臨床應用前景的多能干細胞。2.骨髓間充質干細胞：人體骨髓干細胞細胞數量及增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，從自體骨髓提取間充質干細胞，雖然技術門檻比較低，但需要抽取病人大量骨髓（往往難以做到），其干細胞數量也難以穩定滿足臨床治療的要求。因此骨髓間充質干細胞有一定的局限。第三頁，共七十五頁，2022年，8月28日3.臍帶血干細胞：臍帶血除了包含正常血液的紅細胞、白細胞，淋巴細胞外，還包含單個核細胞、造血干細胞。目前最具應用價值的是利用臍血中的造血干細胞治療白血病（骨髓移植）。利用臍帶血所含的單個核細胞和造血干細胞治療血液病以外的疾病，由于所含干細胞數量稀少（僅占臍血細胞的0.98%），雖然有一定的治療效果，但不能等同于真正意義上的間充質干細胞治療，可作為間充質干細胞治療的補充。4.胚胎干細胞：存在于早期胚胎，獲取胚胎干細胞來源比較困難，道德倫理風險不容忽視，因此胚胎干細胞在臨床治療中使用頗受爭議,胚胎干細胞，又稱全能干細胞，存在于未發育成熟的胚胎，高水平表達端粒酶，可分化為除構成臍胎盤，臍帶等之外的任何一種特定類型細胞。即能長成動物的任何組織和器官。第四頁，共七十五頁，2022年，8月28日(1)全能性干細胞它具有形成完整個體的分化潛能。如胚胎干細胞，具有與早期胚胎細胞相似的形態特征和很強的分化能力，可以無限增殖并分化成為全身200多種細胞類型，進一步形成機體的所有組織、器官。

(2)多能性干細胞這種干細胞具有分化出多種組織細胞的潛能，但卻失去了發育成完整個體的能力，發育潛能受到一定的限制。骨髓多能造血干細胞是典型的例子，它可分化出至少12種血細胞，但不能分化出造血系統以外的其它細胞。

(3)單能干細胞也稱專能或偏能干細胞。這類干細胞只能向一種類型或密切相關的兩種類型的細胞分化，如上皮組織基底層的干細胞、肌肉中的成肌細胞或叫衛星細胞。第五頁，共七十五頁，2022年，8月28日第二節胚胎干細胞的特性形態學特征ES細胞具有與早期胚胎細胞相似的形態結構，細胞核大，有一個或幾個核仁，胞核中多為常染色質，胞質胞漿少，結構簡單。體外培養時，細胞排列緊密，呈集落狀生長。用堿性磷酸酶染色，ES細胞呈棕紅色，而周圍的成纖維細胞呈淡黃色。細胞克隆和周圍存在明顯界限，形成的克隆細胞彼此界限不清，細胞表面有折光較強的脂狀小滴。細胞克隆形態多樣，多數呈島狀或巢狀。小鼠ES細胞的直徑7μm～18μm，豬、牛、羊ES細胞的顏色較深，直徑12μm～18μm。第六頁，共七十五頁，2022年，8月28日特異性標志分子的表達ES細胞的全能性指ES細胞在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內的各種組織的發育潛力，即ES細胞具有發育成完整動物體的能力，可以為細胞的遺傳操作和細胞分化研究提供豐富的試驗材料。ES細胞發育全能性的標志是ES細胞表面表達時相專一性胚胎抗原（Stagespecificembryonicant，SSEA），而且可以檢查到OTC4基因的表達，這兩種蛋白是發育全能性的標志。ES細胞中AKP及端粒酶活性較高，可用于ES細胞分化與否的鑒定。ES細胞的多能性是指ES細胞具有發育成多種組織的能力，參與部分組織的形成。將ES細胞培養在不含分化抑制物的培養基上，可以形成類胚體。將ES細胞在特定培養基進行培養，可以定向分化成特定組織，如ES細胞在含有白血病抑制因子（LIF）和維生素A酸（RA）的培養基上，可以分化形成全壁內胚層，將ES細胞與胚胎細胞共培養或將ES細胞注入囊胚腔中，ES細胞就會參與多種組織的發育。第七頁，共七十五頁，2022年，8月28日細胞周期的特征端粒酶一種自身攜帶模板的逆轉錄酶，由RNA和蛋白質組成，RNA組分中含有一段短的模板序列與端粒DNA的重復序列互補，而其蛋白質組分具有逆轉錄酶活性，以RNA為模板催化端粒DNA的合成，將其加到端粒的3′端，以維持端粒長度及功能。第八頁，共七十五頁，2022年，8月28日第三節胚胎干細胞的分離培養分化抑制物的選擇和培養基的設計早期胚胎的選擇及培養分離及培養過程ES細胞的鑒定ES細胞的冷凍保存ES細胞系的建立及保存第九頁，共七十五頁，2022年，8月28日第十頁，共七十五頁，2022年，8月28日第十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日第四節胚胎干細胞的定向分化胚胎性干細胞定向分化的常用策略分化細胞的鑒定與純化第十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日干細胞應用細胞替代治療角膜病、糖尿病、帕金森病實例組織替代治療如皮膚、軟組織、骨骼等組織病變器官替代無排斥反應的器官移植第十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日干細胞培植眼角膜進行眼角膜移植修補手術干細胞培植心肌細胞治療原發性心臟病第十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日骨髓干細胞可以自行轉移到人腦，并可以轉變為功能齊全的腦細胞治療腦損傷、老年癡呆癥以及帕金森氏綜合癥

第十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日骨髓間充質干細胞加入造血干細胞造血干細胞增殖分化第十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日第十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日雙刃劍人類基因組計劃引發倫理、法律和社會問題克隆人與人獸雜交克隆造成倫理觀念的沖擊生物技術被別有居心者的使用第十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日第十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日動物胚胎干細胞的分離培養技術

EmbryonicStemcells（EScells）一、概述二、胚胎干細胞研究的意義三、胚胎干細胞研究的歷史四、胚胎干細胞分離培養的基本程序五、胚胎干細胞技術目前存在的問題和發展遠景第二十頁，共七十五頁，2022年，8月28日胚胎干細胞技術

EmbryonicStemcells(EScells)一、概述哺乳動物胚胎干細胞（embryonicstemcells,ES細胞）一般是指從早期胚胎經體外分化抑制培養分離出來的具有全能性的細胞。ES細胞是由Evans和Kauf-man1981年首次從延遲小鼠囊胚中分離出來的多能性細胞，當時稱之為EK細胞。以后稱之為胚胎干細胞。第二十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日人胚胎干細胞分離技術途徑ICMPGCs第二十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日ES細胞的特點：ES細胞具有胚胎細胞的特性，在形態上表現為體積小、核大，核仁突出，培養時呈克隆狀生長；在功能上，ES細胞具有發育的全能性，即具有分化為成年動物體內任何一種細胞類型的能力。ES細胞具有細胞系的特征，在飼養層上能維持未分化狀態并實現自我更新。因為可無限增殖，也可冷凍保存。第二十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日二、胚胎干細胞研究的意義ES細胞在哺乳動物個體發生發育規律的研究中極有價值的工具；ES細胞是研究細胞分化的理想手段；圖ES細胞是研究基因功能的首選細胞；Es細胞作為生產轉基因動物的主要途徑之一；ES細胞治療技術將引起一場醫學革命；ES細胞可用于研究細胞癌變機理和新藥物的篩選。第二十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日二、胚胎干細胞研究的歷史1、1981年Evans和Kaufman獲得小鼠ES細胞系2、1988年Doetschman獲得倉鼠ES細胞系3、1994年Wheeler和Robert獲得豬ES細胞系4、1998年Thomson獲得人的ES細胞系5、2007年日本的Yamanaka研究小組和美國的JamesThomson研究小組分別獲得誘導多能性干細胞（inducedpluripotentstemcell，iPS細胞）第二十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日四、胚胎干細胞分離培養的基本程序(一)選擇抑制細胞分化的培養體系1、飼養層培養體系2、條件培養體系3、培養液中添加分化抑制因子體系第二十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日四、胚胎干細胞分離培養的基本程序（二）早期胚胎的選擇（三）胚胎干細胞的分離（四）胚胎干細胞的保持（五）胚胎干細胞的鑒定（六）胚胎干細胞的分化潛力驗證第二十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日五、胚胎干細胞技術目前存在的問題和發展遠景1、根據細胞的分化特點建立更有效的培養體系2、加強胚胎干細胞體外誘導分化研究3、提高家畜胚胎干細胞的分離水平4、加速胚胎干細胞在醫學上的應用第二十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日第七節嵌合體Chimera

嵌合體動物：指由2個以上不同的受精卵或3個以上的配子相結合，有不同基因型的細胞群所構成的復合體。嵌合體動物制作方法：1、集合（凝集）法：在卵裂階段使2個以上的胚胎發生粘著和結合。2、注入法：在臨近著床的胚泡期，用顯微操作方法將另一個體的細胞注入到囊胚腔中。

第二十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日研究現狀：

家畜的嵌合體不但已在個體間和品種間取得成功（綿羊、牛等），而且在異種間也得到了活的后代，如綿山羊人工嵌合體，該技術對遺傳學研究具有重要意義，塑造特異性狀的新奇物種，從而為動物園展示了新的前景，嵌合體也被用來研究免疫學系統的機理。第三十頁，共七十五頁，2022年，8月28日哺乳動物嵌合體生產基本方法示意圖12第三十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日小鼠胚胎囊胚腔注入嵌合法第三十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日嵌合體豬Femalepiglet6899developedfromaDuroc-Pietrainblastocyst(redandblackpigmentation)injectedwithGermanLand-racePGCs(whitepigmentationonheadandlegs).

(B)Chimericpiglets7003(male)and7006(female)withredareasacrossthebackdevelopedfrom‘‘red’’DuroccellsinjectedintoLandraceblastocysts.第三十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日第三十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日誘導產生多能性干細胞的研究里程碑式的科學突破第三十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日細胞重編程的研究概況第三十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日核移植核移植試驗最初是在兩棲動物中實現的，通過將體細胞核注入到去核卵母細胞中。迄今，人們已經獲得了多種核移植動物，也建立了來源于核移植胚胎的胚胎干細胞系。第三十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日體細胞核移植試驗也具有很大的局限性克隆的效率極低產生的許多后代在各個階段都體現出嚴重的發育異常由于需要卵母細胞，核移植實驗在人類中的應用受到強烈的倫理學質疑這些不足，都制約了核移植技術的進一步發展和應用。第三十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日

將成熟的體細胞與多潛能的細胞（ES細胞、胚胎癌細胞等）融合，或者用胚胎干細胞提取物來處理體細胞，也可以在一定程度上使體細胞發生重編程。利用這兩種方法，可以實現某些多功能性標志分子的重新表達和多種分化潛能的獲得。但是，體細胞與多能性細胞的融合率較低，融合之后的細胞具有兩套染色體，并且在移植后會發生排斥現象，這就制約了細胞融合的臨床應用。第三十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日有沒有相對簡單，又可擺脫材料來源和倫理學諸多限制，重編程的效率和程度都十分可觀的新方法呢？第四十頁，共七十五頁，2022年，8月28日里程碑式的科學突破2006年11月20日，日本京都大學的山中伸彌（ShinyaYamanaka)和美國威斯康星大學的詹姆斯·湯姆森（JamesThomson）分別在《細胞》和《科學》雜志上發表重量級論文，宣布他們用基因改造的手段，將人類體細胞改造成了類胚胎干細胞，在功能上幾乎可以和胚胎干細胞相媲美。第四十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日詹姆斯·湯姆森小組的論文發表在11月20日的《科學》雜志上第四十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日俞君英是11月20日《科學》雜志論文的第一作者第四十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日2006年8月，日本科學家山中伸彌小組首先在小鼠身上取得成功第四十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日誘導產生的多功能性干細胞2006年，Takahashi和Yamnaka將幾個轉錄因子導入已分化的小鼠皮膚成纖維細胞，進而獲得了類似于胚胎干細胞的多能性干細胞，稱之為“誘導產生的多功能性干細胞”（inducedpluripotentstemcells,iPS細胞）。這一研究明確地證實了分化的細胞可以通過少數幾個因子的外源導入而被重編程到具有多能性的狀態，因而受到了整個生命科學領域的廣泛關注。第四十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日在研究誘導多功能性干細胞產生的原理機制之前，先了解一下體細胞重編程逆轉為干細胞的研究進展體細胞重編程的過程體細胞重編程的原理體細胞不經過胚胎逆轉為多能干細胞的方法第四十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日成體細胞核的重編程1.核重編程：核移植后供體核停止本身的基因表達程序，恢復為胚胎發育所必需的胚胎化基因表達程序狀態。此過程包括：染色體結構重建、DNA甲基化、組蛋白乙酰化、印記基因表達、端粒長度恢復、X染色體失活等。第四十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日甲基化

1.2.合子型基因的重新激活，如：Oct-42.重塑核結構主要有包括核纖層A、B、C三種核纖層蛋白的重塑第四十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日第四十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日3.細胞質重編程—miRNAmiRNA是決定細胞分化方向的因子。細胞中miRNA成分的改變能提高細胞對調節基因表達重編程。第五十頁，共七十五頁，2022年，8月28日接下來，介紹一下體細胞重編程不經過胚胎逆轉為多能干細胞的方法之一：通過特定基因的表達將體細胞重編程過程逆轉為干細胞。“基因重新編排技術”，借助“逆轉錄酶病毒”為載體,即向皮膚細胞中植入一組4個基因(Oct4,Sox2,c-myc和Klf4)，通過基因重新編排，使皮膚細胞具備胚胎干細胞的功能。這種被改造過的細胞稱作“iPS細胞”。第五十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日下面簡單介紹一下這些研究中所用到的多能性相關因子Oct4,Sox2,c-myc和Klf4在多能性調控中的作用。第五十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日1.Oct3/4Oct-4（也稱Oct-3）屬于POU轉錄因子家族的一員[1~3]。是哺乳動物胚胎發育的一個關鍵的調控因子。是全能性的標志，它能夠促使ICM形成、維持胚胎干細胞未分化前狀態并促進其增殖。第五十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日2.SOX2基因SOX2基因是編碼轉錄因子的主控基因（mastergenes）家族的一個成員。轉錄因子是些與DNA結合并調節其他基因表達的蛋白質第五十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日3.癌癥基因c-MYC癌癥基因c-MYC，是一種最容易過渡表現于人類的致癌基因，它對某些成體干細胞的自我更新起一定的作用，并可以抑制ES細胞的分化。第五十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日4.Klf4Krueppel-likefactor4，KLF4上皮鋅指轉錄因子Klf4(舊稱GKLF)調節體外細胞的增生與分化第五十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日iPS細胞誘導機制已分化的細胞導入病毒基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4病毒逆轉錄胚胎干細胞培養條件和篩選Ips細胞第五十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日誘導多功能細胞第五十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日第五十九頁，共七十五頁，2022年，8月28日我們已經了解了體細胞重編程的原理和誘導多功能干細胞的產生機制，下面讓我們再深入了解一下Ips細胞的研究概況和Ips細胞系建立的一些重要環節。第六十頁，共七十五頁，2022年，8月28日Ips細胞的研究概況（研究方法）這是一種具有很強創新性的研究方法：通過外源導入與多功能相關并且能使重組細胞恢復全能性的轉錄基因來誘導體細胞核發生重新編程，從而使體細胞轉變成多能性干細胞。這種方法所受的啟示來源于“ES細胞-體細胞融合實驗”。細胞的多能性收到許多因子精密而又復雜的調控。ES細胞和體細胞融合后能誘導體細胞核的重新編程，ES細胞中存在著一些因子，這些因子對于多能性的建立可能至關重要。第六十一頁，共七十五頁，2022年，8月28日第六十二頁，共七十五頁，2022年，8月28日Ips細胞的研究概況（兩個相關實驗）Ips細胞首先由科學家Takahashi和Yamanaka在2006年建立的。實驗原理如下：利用逆轉錄病毒載體在小鼠成纖維細胞中導入了4個與多功能性有關的基因：Oct4,Sox2,c-myc和Klf4。利用多能性標志分子Fbx15的表達對轉染后的細胞進行了篩選，最終的到了ips細胞，這種細胞的功能和性能幾乎和胚胎干細胞一樣。另一個實驗的對象是人類皮膚成纖維細胞的重編程，而實驗的過程和上一個實驗基本相同；。只是對所篩選的轉錄基因做了一下修飾：去掉了腫瘤相關因子c-Myc，使ips細胞的生產更加安全第六十三頁，共七十五頁，2022年，8月28日Ips細胞系建立的一些重要環節

（幾種因子的發現過程）日本科學家發現ES細胞中那個存在著一些因子，這些因子對于多能性的建立可能至關重要。科學家對24個與多能性維持相關的候選基因導入小鼠成纖維細胞中，依次去掉其中一個基因，最后在得到的10個基因中發現了4個至關重要的基因，其中任何一個缺失都將導致實驗的失敗，這4個基因中的任意2個或3個組合都無法形成具有ES細胞特性的ips細胞。從而確定了：Oct4,Sox2,c-myc和Klf4這4種基因第六十四頁，共七十五頁，2022年，8月28日人類ES細胞能夠通過細胞融合實驗室體細胞發生重編程。美國科學家比較了人類ES細胞和髓前體細胞的基因表達譜，挑選出許多在ES細胞和髓前體細胞的基因表達譜，挑選出許多在ES細胞中相對高表達的基因。再根據這些基因在多能性調控中的已知功能對其進行了排序，從中選出14個候選基因。將這些基因以不同的組合方式導入一種由人類ES細胞分化得到的間充質樣細胞后，檢驗了不同基因的導入對這種細胞重編程的作用。最后鎖定了4種因子：Oct4,Sox2,Nanog,Lin28.第六十五頁，共七十五頁，2022年，8月28日Ips細胞系建立的一些重要環節

（Ips細胞的篩選）

Ips細胞的篩選：主要有三種方法：形態學篩選、藥物篩選和選用對多能性更為關鍵的基因作為報告基因。其中利用Fbx15對ips細胞進行篩選，原理是Fbx25對于多能性的維持和胚胎的發育來說是不可缺少的基因，所以Fbx25作為篩選ips細胞的報告基因。僅利用形態學的標準來代替報告基因的篩選。Maherali等人發現，僅僅依靠形態學篩選可能就足以建立ips細胞系。后來的研究證實了在不對供體細胞做任何額外遺傳修飾的情況下，僅依靠形態學篩選的標準對細胞進行篩選也能夠分離出小鼠的ips細胞。 利用基因重組技術建立了具有藥物抗性基因的體細胞，這些細胞的抗性受內源性Nanog或Oct4表達的調控。這兩個基因的作用是維持細胞多能性，從而利用這種篩選的方法建立了穩定的ips細胞系，這些細胞系在各個方面都表現出了極為相似的特性。第六十六頁，共七十五頁，2022年，8月28日iPS細胞的應用價值和發展方向第六十七頁，共七十五頁，2022年，8月28日1、利用iPS細胞作為實驗模型，只操縱幾個因子的表達，加速對多能性調控機理的深入研究。2、獲得的方法相對簡單穩定，不涉及胚胎的破壞，無倫理道德限制。3、對于疾病機理研究和新藥開發等方面將有很大貢獻。4、可望制造特定病人來源的iPS細胞，用“個性化”移植來治療諸多疾病。第六十八頁，共七十五頁，2022年，8月28日誘導性多能干