蛋白質相對分子質量的測定（SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法）原理用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離鑒定蛋白質（protein），主要依賴于電荷效應和分子篩效應，再與標準樣品對照即可確定各區帶的成分。要利用凝膠電泳測定某樣品的蛋白質相對分子質量，就必須去掉其電荷效應，使樣品的蛋白質分子的遷移率完全取決于相對分子質量。如在電泳體系中加入一定濃度的十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate，簡稱SDS）。這種陰離子表面活性劑濃度大于1mmol/L時，以1.4eSDS與1g蛋白質分子結合成復合物使蛋白質帶負電荷，這種負電荷遠遠超過了蛋白質分子原有的電荷差別、從而降低或消除了各種蛋白質天然電荷差別。巰基乙醇是蛋白質分子中二硫鍵的還原劑，可使多肽組分分成單個亞單位。SDS可打斷蛋白質的氫鍵。因此它與蛋白質結合后，還引起蛋白質構象的改變。此復合物的流體力學和光學性質均表明，它們在水溶液中的形狀近似長橢圓的棒狀。不同蛋白質-SDS復合物的短軸相同，約1.8nm，而長軸改變與蛋白質的相對分子質量成正比。所以，各種SDS-蛋白質復合物在電泳中的遷移率不再受原有電荷和形狀的影響，而只是按照分子的大小由凝膠的分子篩效應進行分離，其有效遷移率與相對分子質量的對數成線性關系。這樣就可以根據標準蛋白質相對分子質量的對數和遷移率所作的標準曲線得出未知樣品蛋白質的相對分子質量。二、材料、儀器設備及試劑（一）材料小麥芽。（二）儀器設備垂直板電泳槽及附件，直流穩壓穩流電泳儀，微量進樣器，其他常用用具。（三）試劑（1）下層膠緩沖液：18.17gTris、0.4gSDS，溶于水.用1mol/LHCl調pH至8.8，定容至100mL。（2）上層膠緩沖液：6.06gTris，0.4gSDS、溶于水，用1mol/LHCl調pH至6.8，定容100mL。（3）Acr/Bis貯備液：30gAcr、0.8gBis，溶解后定容至100mL。（4）10%過硫酸銨，用時現配。（5）樣品緩沖液：Tris0.6g、甘油5mL，SDS1g溶于水，用HCl調pH至8.0，再加溴酚藍0.1g，巰基乙醇2.5mL，定容至100mL。（6）電極緩沖液：Tris3.03g、Gly14.14g、SDS1.0g，溶于水，用HCL調pH至8.3，定容至1000mL。（7）染色液的配制：45%甲醇、0.25%考馬斯亮藍R-250。（8）脫色液：2.5%甲醇、10%醋酸。（9）1.5%瓊脂：1.5g瓊脂溶于100mL電極緩沖液中，加熱溶解。（10）標準相對分子質量蛋白質。三、實驗步驟1.電泳槽的安裝干燥的兩塊玻璃板裝入配套塑料夾套內，垂直固定在電泳槽上，周邊用1.5%的瓊脂密封（圖2-28-1）。2.樣品處理將各種標準蛋白質和待測樣品（同實驗27）分別溶于蛋白質處理液（濃度為2mg/mL），在沸水中加熱3～4min，待冷卻后作點樣用。3.制膠選擇合適的膠濃度按表2-28-1配制7.5%的分離膠，混合后將其沿長玻瑞板加入兩塊玻璃板之間（小心不要產生氣泡），加到距短玻璃板上邊緣3cm處，立即覆蓋2~3mm水層，靜止聚合約40min左右。膠聚合好的標志是膠與水之間形成清晰的界面。吸取分離膠的水分，將配制好的濃縮膠（參照表2-28-1）注入分離膠之上，立即插上有機玻璃的點樣槽模板，待濃縮膠聚合好備用。4.點樣用微量注射器分別吸取標準蛋白質樣品液5gL，按相對分子質量（從小到大）的順序注入樣品槽內的濃縮膠面上，同時吸取待測樣品液25μL，注入其他樣品槽內，在樣品上小心地注入電極緩沖液。5.電泳加樣完畢，兩槽注入電極緩沖液，接通電源（上負下正），調節電流為15mA，當指示劑進入分離膠后，電流需加大到30mA，電壓恒定在80~100V之間，約3~4h后，指示劑達到距前沿1~2cm時，可終止電泳（若pH不發生變化，電極緩沖液可反復使用，但上、下槽電極液應分開貯存，這樣可防止在電泳過程中，剛從膠中遷移下來的鹽離子等物質干擾下次電泳）。6.固定膠取出后，在水中浸泡10min，浸出部分SDS，然后將膠浸泡在25%異丙醇和10%乙酸的混合液中1h，蛋白質就得到固定了。7.染色取出凝膠板，測定膠長（D1）后，加入染色液染色2h。脫色將膠放在脫色液中脫色0.5h，每隔0.5h換一次脫色液，至少換3次，待藍色基本脫掉，再放在脫色液里浸泡至蛋白質譜帶清晰為止，精確測定膠長（D2）。四、蛋白質標準樣品遷移率和待測樣品相對分子質量的計算精確測量溴酚藍和各種蛋白質遷移距離。把溴酚藍遷移的距離定為d.，蛋白質遷移距離定為d2，并以D1定為凝膠染色前的長度，D2定為凝膠染色后的長度。根據下面公式計算各種蛋白質的遷移率R㎡:以標準蛋白質的遷