課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)專題2:微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用微生物包括哪五類：病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動(dòng)物原核生物界原生生物界真菌界病毒界微生物基礎(chǔ)知識(shí)（一）細(xì)菌細(xì)菌：?jiǎn)渭?xì)胞不分枝的原核微生物。細(xì)菌細(xì)胞微小而透明，通常用適當(dāng)染料染色后顯微鏡觀察圖1-1常見的三種細(xì)菌典型形態(tài)A.球菌

B.桿菌C.弧菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：堅(jiān)韌且有彈性細(xì)胞壁有哪些功能？①固定細(xì)胞外形；

②保護(hù)細(xì)胞免受外力的損傷；

③阻攔大分子物質(zhì)進(jìn)人細(xì)胞；④使細(xì)胞具有致病性及對(duì)噬菌體的敏感性。傷寒桿菌細(xì)胞壁中含毒素芽孢有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時(shí)以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)菌.菌落：?jiǎn)蝹€(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。菌落細(xì)菌的菌落特征因種而異鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素

微生物中發(fā)現(xiàn)了幾千種抗生素，其中2/3是由放線菌產(chǎn)生的

應(yīng)用:病毒

朊病毒（蛋白質(zhì)病毒）2、病毒的增殖：（四）真菌如圖是酵母菌電子顯微鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)酵母菌和霉菌青霉生殖直立菌絲營(yíng)養(yǎng)菌絲腐生生活孢子生殖培養(yǎng)基的種類液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基據(jù)物理性質(zhì)分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基據(jù)化學(xué)成分分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基據(jù)用途分常用于工業(yè)生產(chǎn)常用于觀察微生物的運(yùn)動(dòng)、鑒定菌種用于微生物的分離、計(jì)數(shù)常用于工業(yè)生產(chǎn)常用于分類、鑒定在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長(zhǎng)，促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng)。例如，在培養(yǎng)基中加入青霉素，以抑制細(xì)菌、放線菌的生長(zhǎng)，從而分離到酵母菌和霉菌。又如，在培養(yǎng)基中加入高濃度的食鹽可以抑制多種細(xì)菌的生長(zhǎng)，但不影響金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。根據(jù)微生物的代謝特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成，用以鑒別不同種類的微生物。例如，在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍(lán)，可以用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細(xì)菌：如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤。液體培養(yǎng)基：表面生長(zhǎng)均勻混濁生長(zhǎng)沉淀生長(zhǎng)半固體培養(yǎng)基：無動(dòng)力有動(dòng)力(彌散)(是否運(yùn)動(dòng))

大腸桿菌呈黑色中心,有金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上典型特征

鑒定培養(yǎng)基：鑒定所培養(yǎng)生物的類型2、培養(yǎng)基配制原則：

（1）目的要明確：根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等確定配制培養(yǎng)基的種類，因?yàn)椴煌奈⑸飳?duì)培養(yǎng)物質(zhì)的需求不同。（2）營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)：注意各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例。（3）pH要適宜：各種微生物適宜生長(zhǎng)的pH范圍不同。細(xì)菌pH為：6.5-7.5；放線菌pH為：7.5-8.5；真菌pH為：5.0-6.0。3、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成

不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、無機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),例如:生長(zhǎng)因子(即細(xì)菌生長(zhǎng)必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。

（二）無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)的概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。成功地培養(yǎng)微生物的關(guān)鍵。無菌技術(shù)包括：

（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；

（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌；

（3）為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近旁進(jìn)行；

（4）避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。

（１）消毒定義：

指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物。（不包括芽孢和孢子）2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別

使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子，而達(dá)到完全無菌之過程。

滅菌消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。（2）滅菌的定義：消毒與滅菌的比較1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法1、灼燒滅菌接種環(huán)、接種針、試管口2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.(2)滅菌的方法：

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時(shí)可以基本保持培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計(jì)的。

1.無菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇合適的方法。（1）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。旁欄思考3.微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的基本操作程序1、器具的滅菌2、培養(yǎng)基的配制3、培養(yǎng)基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種的保存三、實(shí)驗(yàn)操作（一.）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細(xì)菌）1．計(jì)算、稱量2．溶化3．調(diào)pH：pH7．6

4．過濾：這一步可以省去。5．分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。6．加塞7．包扎操作步驟8．滅菌:將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)皿用舊報(bào)紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃下滅菌2h。9．倒平板:待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時(shí)，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種.10．無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時(shí)，以檢查滅菌是否徹底。倒平板技術(shù)1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？問題討論答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。（二）、純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法

平板劃線法:通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面.

在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落.微生物的接種技術(shù)菌落：?jiǎn)蝹€(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。菌落細(xì)菌的菌落特征因種而異霉菌的菌落特征因種而異菌落接種環(huán)接種針問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。

2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。涂布器問題討論

涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？

應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。微生物的恒溫培養(yǎng)微生物的恒溫培養(yǎng)四、課題成果評(píng)價(jià)

（一）培養(yǎng)基的制作是否合格如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點(diǎn)，

(在肉湯培養(yǎng)基上，大腸桿菌菌落呈白色，為圓形，光滑有光澤，邊緣整齊)則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，(在某培養(yǎng)基上出現(xiàn)了3種特征不同的菌落，原因有培養(yǎng)基滅菌不徹底或雜菌感染等。)則說明接種過程中，無菌操作還未達(dá)到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。（三）是否進(jìn)行了及時(shí)細(xì)致的觀察與記錄培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同，及時(shí)觀察記錄的同學(xué)會(huì)發(fā)現(xiàn)這一點(diǎn)，并能觀察到其他一些細(xì)微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。微生物的恒溫培養(yǎng)3．1培養(yǎng)未接種培養(yǎng)基的作用是對(duì)照，若有菌落形成，說明培養(yǎng)基滅菌不徹底。3．2在肉湯培養(yǎng)基上，大腸桿菌菌落呈白色，為圓形，光滑有光澤，邊緣整齊。3．3培養(yǎng)12h和24h后的菌落大小不同（相同、不同）；菌落分布位置相同（相同、不同）。原因是時(shí)間越長(zhǎng)，菌落中細(xì)菌繁殖越多，菌落體積越大；菌落的位置不動(dòng)，但菌落數(shù)增多。3．4在某培養(yǎng)基上出現(xiàn)了3種特征不同的菌落，原因有培養(yǎng)基滅菌不徹底或雜菌感染等。結(jié)果分析與評(píng)價(jià)課題延伸（P20）菌種的保存1、臨時(shí)保藏法對(duì)象：溫度：缺點(diǎn)：

2、甘油管藏法：

對(duì)象：

溫度：頻繁使用的菌種4℃（冰箱）容易被污染或產(chǎn)生變異長(zhǎng)期保存的菌種-20℃（冷凍箱）本課題知識(shí)小結(jié):【典例解析】例1．關(guān)微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機(jī)物只提供無機(jī)鹽D.無機(jī)氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對(duì)微生物的具體情況分析。對(duì)于A、B選項(xiàng)，它的表達(dá)是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時(shí)是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時(shí)是能源，如葡萄糖；有的碳源同時(shí)是氮源，也是能源，如蛋白胨。對(duì)于C選項(xiàng)，除水以外的無機(jī)物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機(jī)鹽；而NaCl則只能提供無機(jī)鹽。對(duì)于D選項(xiàng)，無機(jī)氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。答案：D例2．下面對(duì)發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是A.防止雜菌污染B.消滅雜菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌D.滅菌必須在接種前答案：B解析：滅菌