關于鼠疫檢測新技術新方法第1頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六一、核酸檢測技術（PCR檢測）二、標記檢測技術（ELISA，膠體金）第2頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六一、核酸檢測技術定義：對動植物、微生物的基因序列進行測定。

核酸的分離與純化內容：聚合酶鏈式反應(PCR技術)

核酸雜交技術第3頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六核酸的純化與分離目的：獲得完整的核酸一級結構，并提高核酸純度。

破碎細胞（細菌）

技術流程核酸提取

核酸純化第4頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六材料的前處理細胞破碎，核酸釋放核酸分離、純化沉淀或吸附核酸，去除雜質核酸溶解緩沖液第5頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六全自動核酸、蛋白提取儀第6頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六聚合酶鏈式反應（PCR技術）

簡史：1971年，Khorana提出：DNA變性后，與合適引物進行雜交，在DNA聚合酶作用下，延伸引物，并不斷重復該過程，即可克隆tRNA基因。1985年，Mullis等人發明聚合酶鏈反應（PCR），隨后，Mullis所屬公司PE推出第一臺PCR自動化熱循環儀。第7頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六基本原理：第8頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六基本步驟第9頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六第10頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六實時定量PCR儀PCR儀第11頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六凝膠成像系統凝膠電泳系統第12頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六PCR結果判定（凝膠電泳）第13頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六PCR類型：

1.多重PCR

2.巢式PCR

3.定量PCR

4.反向PCR

5.逆轉錄PCR

第14頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六PCR技術在鼠疫檢測中的應用鼠疫菌PCR檢測法：從疑似鼠疫的標本（全血、組織）中檢測鼠疫菌，以鼠疫菌fra和pla基因片段作為PCR擴增目的片段。鼠疫判定標準：PCR擴增（fra+

pla）

+

膠體金抗原檢測or酶聯免疫吸附試驗or反相血凝試驗=確診鼠疫第15頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六鼠疫菌核酸檢測樣本處理樣本類別1.鼠疫菌培養物2.鼠疫病人血液、痰液或尸檢標本3.自斃或捕獲動物血液或組織臟器（肝臟、脾臟等）4.媒介昆蟲第16頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六樣品處理方法1.煮沸法2.DNA提取試劑盒3.CTAB法4.氯仿抽提法第17頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六第18頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六鼠疫菌PCR檢測反應體系10xbufferdNTPsFra-F（5’-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3’）Fra-R（5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’）Pla-F（5’-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3’）Pla-R（5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’）Taq聚合酶待檢測模板（基因組DNA）去離子水第19頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六鼠疫菌PCR檢測反應程序預變性95℃5min1個循環變性95℃1min退火72℃1min延伸72℃1min變性72℃5min30個循環第20頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六M123456內參基因PlaFra鼠疫PCR檢測電泳結果判定陽性結果：內參基因+Pla+Fra陰性結果：內參基因第21頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六核酸雜交技術

待檢測DNA或RNA先轉移并固定到硝酸纖維素或尼龍膜上，與其互補的單鏈DNA或RNA探針用放射性或非放射性標記。在膜上雜交時，探針通過氫鍵與其互補的靶序列結合，洗去未結合的游離探針后，經放射自顯影或顯色反應檢測特異結合的探針。第22頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六二、標記檢測技術標記技術：用標記物質熒光素、同位素或酶等示蹤物質標記抗體（或抗原）進行抗原-抗體反應。通過測定標記物-抗原-抗體復合物來定性或定量的檢測標本中的抗體或抗原。第23頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六標記檢測特點：標記免疫技術=免疫技術+

標記技術抗原抗體反應示蹤物標記靈敏性特異性標記免疫技術的主要特點：高特異性、高靈敏性第24頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六鼠疫標記檢測技術ELISA膠體金第25頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六ELISA技術原理：1.使抗原或抗體結合到到某種固相載體表面,并保持其免疫活性.2.在測定時,把受檢標本和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面抗原抗體反應.3.用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其它物質分開,最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質量成一定比例.4.加入底物,通過顏色變化來測定.第26頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六ELISA的類型：間接法第27頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六雙抗夾心法第28頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六ELISA技術在鼠疫檢測中的應用1.檢測鼠疫F1抗原（or抗體）原理：以雙抗體夾心法測定F1抗原為例。采用F1抗體包被反應板，加入待測標本，反應除去未結合物質，加入HRP-F1MCAb，如待測標本中含有F1抗原時就與包被F1抗體、HRP-F1抗體結合形成復合物，加入OPD底物產生顯色反應，反之就無顯色反應。所需試劑及器材：HRP-F1McAb凍干劑，F1McAb包被板，鼠疫F1陽性對照、陰性對照，PBS（稀釋液）,顯色液（鄰苯二胺），終止液（2M硫酸）。ELISA檢測工作站，ELISA洗板機、振蕩器等第29頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六第30頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六第31頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六ELISA結果判讀：1.目測：平持反應版，距白色背景5-10cm，從板的正上方觀察。（+++）深黃棕色；（++）淺黃棕色；（+）顏色明顯可見；（-）無色或顏色很淺2.ELISA檢測工作站

標本OD/陰性OD>2.1位陽性。

第32頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六ELISA操作注意事項：（一）加樣

加樣時應將所加物加在Elisa板孔的底部，避免加在孔壁的上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。

加標本一般用微量加樣器，每次加標本應更換吸頭，以免交叉污染。（二）保溫

在Elisa中一般有二次抗原抗體反應，此時反應的溫度和時間應按規定的要求，保溫容器最好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。

為避免蒸發，板上應加蓋，或將平板置于濕盒中。第33頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六（三）洗滌

洗滌的目的是吸取反應液中沒有與固相抗原或抗體結合的物質以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質。洗滌一般采用以下方法：1、吸干孔內反應液。2、將洗滌液注滿孔板。3、放置3分鐘，略作搖動。4、吸干孔內液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干，洗滌次數3-4次，又是需洗5-6次。（四）顯色和比色

顯色的最后一部是溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產物，反應溫度和時間仍是影響顯色的因素，在定量測定中加入底物后的溫度和時間應按規定力求準確，而在定性測定中，可根據顯色程度適當提高溫度，或者適當縮短或延長反應時間。第34頁，共38頁，2022年，5月20日，19點1分，星期六膠體金檢測技術：原理：將F1-McAb抗體以條帶狀固定在NC膜上，膠體金標記F1-McAb吸附在結合墊上，