單克隆抗體的標記方法目前動物用單抗，在動物疫病診斷和檢疫、妊娠檢測、性別鑒定等方面有廣泛的應用，大多以診斷試劑（盒）的形式提供，其中核心試劑為標記的單抗。下面將介紹最常用的幾種標記技術。（1）酶標記A.辣根過氧化物酶（HRP）標記辣根過氧化物酶（HRP）標記單抗和多克隆抗體的常用方法是過碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過碘酸鈉氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基與IgG氨基結合，形成Schiff氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發生偶合，在用過碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應末了，用硼氫化鈉穩定Schiff氏堿。這里介紹兩種程序。程序一：a.

將5mgHRP溶于0.5ml0.1mol/LNaHCO3溶液中；加0.5ml10mmol/LNaIO4溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時。b.

加0.75ml0.1mol/LNa2CO3混勻。c.

加入0.75ml小鼠已處理的腹水，或純化單抗等（15mg/ml），混勻。d.

稱取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口墊玻璃棉的5ml注射器外筒內；隨后將上述交聯物移入注射器外套；蓋緊，室溫作用（避光）3小時或4℃過夜。e.

用少許PBS將交聯物全部洗出，收集洗出液，加1/20V體積新鮮配制的5mg/mlNaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘；再加入3/20VNaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時（或4℃過夜）。f.

將交聯物過SephadexG200或Sepharose6B（2.6×50cm）層析純化，分管收集第一峰。g.

酶結合物質量鑒定：克分子比值測定酶量（mg/ml）=OD403×0.4IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×0.3）×0.62克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之間。酶結合率=酶量×體積/抗體，標記率一般為0.3-0.6，即1-2個HRP分子結合在一個抗體分子上，標記率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等于0.4時，E/P約為1。標記率=OD403/OD280酶活性和抗體活性的測定可應用ELISA法、免疫擴散、DAB-H2O2顯色反應測定酶結合物的酶活性，抗體活性及效價、特異性。h.HRP抗體結合物的保存：加入等量甘油后，小量分裝－20℃存放，防止反復凍融；或加入等量60%甘油4℃保存；不宜加NaN3或酚防腐，否則會影響酶活性。必要時凍干保存，以BSA或脫脂牛奶作保護劑。程序二：1.將5mgHRP溶于0.3mol/LPH8.1NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯無水乙醇溶液0.1ml，室溫攪拌作用1小時，以封閉HRP分子上的α和ε氨基。2.再加1ml0.06mol/L過碘酸鈉溶液，在室溫中避光輕攪30分鐘，溶液呈黃綠色；隨后加1ml0.06mol/L乙二醇，輕攪1小時，中止氧化反應。3.移入透析袋中，在1000ml0.01mol/LPH9.5碳酸鹽緩沖液中，4℃透析過夜，更換三次緩沖液，注意避光。4.吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mgIgG的碳酸鹽緩沖液1ml，室溫輕攪2-3小時，避光；加入5mgNaBH4，4℃放置3小時或過夜，或換用乙醇胺（2mol/LPH9.5）0.2ml，作用7小時。5.再移入透析袋中，在0.02mol/LPH7.4PBS中透析24小時，更換三次緩沖液。6.用3000r/min離心30分鐘，除去沉淀物。上清液再用半飽和硫酸銨鹽析三次，沉淀用少許PBS溶解，透析或層析除鹽，必要時進一步層析純化。7.8.步驟同程序一。B.堿性磷酸酶（AP）標記堿性磷酸酶（AP）用于標記抗體，常用戊二醛一步法，將酶和單抗混合，再加入適量戊二醛，使酶和抗體蛋白的NH2分別與兩個醛基結合，制備成結合物。該法簡便，但所得產物不均一，抗體活性損失大，酶標記率低。其程序如下：1.將5mgAP加入1ml抗體溶液（2mg/ml）中溶解，裝入透析袋，于4℃對0.01mol/LPH7.2PBS透析18小時，換液三次。2.加入2.5%戊二醛20ul，室溫作用1-2小時，4℃對PBS透析過夜，其間換液三次。3.換用0.05mol/LPH8.0Tris-HCl緩沖液透析，4℃過夜，換液三次。4.取出標記抗體，用含1%BSA的Tris-HCl緩沖液稀釋至4ml，即為AP標記物原液。5.每毫升中加入0.4ml甘油，小量分裝，保存備用。C.PAP、APAAP的制備PAP（過氧化物酶－抗過氧化物酶橋聯酶標技術）、APAAP（堿性磷酸酶－抗堿性磷酸酶橋聯酶標技術）的制備對于日益廣泛使用單抗的免疫細胞化學有重要意義。現在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、綿羊和兔PAP、APAAP試劑供應，只要配以相應的橋抗體，即可非常便利地應用單抗。因為PAP法和APAAP法不用任何化學交聯劑處理酶和抗體，它們的活性均不受化學因素的影響，提高了敏感性和特異性。PAP和APAAP試劑的制備方法常采用先將HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或單抗中而獲得免疫沉淀物，再加入酶鹽水，過量的酶有助于免疫沉淀物的解離反應，調PH至2.3，隨后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半飽和硫酸銨，純化PAP或APAAP。根據需要還可將PAP和APAAP試劑先與相應橋抗體結合后，再與特定單抗組成完整的診斷試劑，這樣，單抗即可一步法用于診斷或檢測試驗等。（2）熒光素標記A.異硫氰酸熒光素（FITC）標記FITC標記抗體的原理是在堿性條件下，FITC的異硫氰基能與IgG的自由氨基結合，形成IgG與熒光素的結合物。FITC是最常用的熒光素，其次選用TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明）。FITC和TRITC是常用的雙標記組合。其標記步驟如下：a.以碳酸鹽緩沖液（PH9.3，Na2CO38.6g，NaHCO317.3g，蒸餾水1000ml）調整抗體濃度至10mg/ml。b.取5ml抗體溶液置于10ml小燒杯中。c.稱取1mgFITC溶于0.2mlDMSO中，待溶解后立即緩慢滴加于抗體液內，邊加邊輕攪；其后室溫避光作用2小時。d.將交聯物經SephadexG25或G50柱層析除去游離的熒光素；分管收集第一峰為標記的抗體。e.FITC的結合物質量鑒定IgG量（mg/ml）=（OD280-OD495×0.35）/1.4F/P=2.87×OD495/（OD280-OD495×0.35），一般說，FITC對抗體的摩爾比為3：1時適合于組織切片染色，為5-6：1時適合于細胞懸液染色。以標記抗體染色各種抗原，測定其特異性染色滴度和非特異染色的程度。f.標記抗體的保存：宜保存于4℃，加NaN3防腐。B.異硫氰酸羅丹明（TRITC）標記：基本與FITC標記相同。（3）同位素標記必須強調的是在使用同位素標記單抗或其他蛋白之前，應掌握同位素操作和防護知識。正常情況下應包括避免物理的接觸和對γ－射線照射的有效保護，操作和使用同位素標記抗體時，應利用防護裝置，并合理處置含放射性的廢料。A.碘標記用碘標記抗體是一種有效的標記方法。125I衰變產生低能的γ和Χ射線，很容易被檢測出來，而其60天的半衰期保證足夠的有效使用期，且能很方便地處理放射廢料。最常用的碘標記方法是氯胺T法，即將氧化劑氯胺T加入到抗體和碘化物的溶液中，Na125I在氯胺T作用下I轉化成I2，游離I2可與抗體分子中酪氨酸和一些組氨酸發生鹵化反應，用還原劑和游離酪氨酸終止反應，經凝膠過濾將標記的抗體與碘化酪氨酸及還原劑分離開。其主要操作步驟如下：a.在進行標記之前，先選用截流分子量為20000-50000的凝膠，制備1ml凝膠柱，然后分別用10倍體積的1%BSA/PBS/0.02%疊氮鈉和PBS洗滌柱體，封住柱下口，備用。b.加入10ug純化單抗至含有25ul2.5mol/L磷酸鈉（PH7.5）的1.5ml指形管內。隨后，加入500uCiNa125I混勻。c.加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。室溫放置60秒。再加入50ul氯胺T終止液（含2.4mg/ml偏重亞硫酸鈉，10mg/ml酪氨酸，10%甘油和0.1%環乙烷酰二甲苯的PBS）。d.將上述碘標記物上樣在凝膠柱表面，小心放開柱體下口，用1.5ml指形管收集。當碘標記物全部進入柱體，加入0.3ml含0.03%疊氮鈉的PBS，用另一指形管收集0.3ml，然后再加0.3ml0.03%NaN3PBS，下口收集0.3ml，重復進行，同時用同位素檢測儀測定標記與未標記的單抗。標記抗體大約在第二至第四管出現。無害化處理柱子和非單抗標記部分。e.將標記單抗保存于4℃可使用6周時間。B.生物合成法標記將雜交瘤細胞培養在含有放射性前體的培養基中，隨著抗體分子的合成、組裝，同位素會標記在抗體分子的初級氨基酸鏈上，本方法不會導致抗體活性的喪失。其主要步驟是：a.離心收集處于對數生長期的雜交瘤細胞，約需2×106個細胞。以預熱37℃不含甲硫氨酸的培養基洗滌上述細胞。b.用含2%PBS不含甲硫氨酸的培養基懸浮雜交瘤細胞至106個/ml，加入35S甲硫氨酸（每次加入100uCi可產生105-106cpm的抗體）。c.經C02培養箱中培養過夜，離心后，吸出培養上清，分別加入1/20體積的1mol/LTris（PH8.0）及疊氮鈉至濃度0.02%。該標記抗體可按純化單抗方法進行。（4）生物素標記生物素標記反應常用生物素琥珀酰亞胺酯進行。生物素是與抗體分子的游離賴氨酸等發生偶聯反應而完成標記。其主要步驟是：a.用二甲基亞砜配制10mg/ml的N－羥琥珀酰亞胺生物素（應根據需要選用不同大小和間臂長的生物素化琥珀酰酯）。b.用硼酸鈉緩沖液（0.1mol/L，PH8.0）稀釋單抗溶液至1-3mg/ml。c.每毫克抗體加入25-250ug的生物素酯，混勻后，室溫作用4小時。e.按每250ug生物素酯加入20ul1mol/LNH4Cl終止反應，室溫放置10分鐘。f.以PBS充分透析除去游離生物素，標記抗體凍存。（5）他標記技術適用于蛋白質的其他標記方法也可用于單抗，如金標記、化學發光標記、SPA標記、鐵蛋白標記等。馬傳貧病毒單克隆抗體的制備（案例）材料與方法1．抗原動物及免疫方法抗原為哈爾濱獸醫研究所保存的馬傳貧病毒株培養物制備的可溶性抗原。免疫動物為6～8周齡的Balb/c鼠。初次免疫用含完全佐劑抗原0.2ml（病毒含量為1.0×108／ml制備的可溶性抗原）腹腔接種，經2周再次免疫接種，應用不完全佐劑抗原0.2ml腹腔接種，再經3周強化免疫，接種可溶性抗原0.3ml，3天后取脾臟。2．細胞培養SP2/0鼠骨髓瘤胞株，培養液為含0.025Mol/LHEPES的RPMI－1640（pH7.3），另加新生牛血清15％NEAA液1％，丙酮酸鈉（1.1％）和谷氨酰胺（2.92％）各1％，青鏈霉素（100U或μg/ml）1％，39℃CO2培養箱中孵育，CO2濃度為5％。3．細胞融合及克隆化取SP2/0鼠骨髓瘤細胞1.0×107/ml和脾細胞2.0×107個/ml，離心沉淀棄上清，然后向細胞沉淀中加入細胞融合劑0.7ml（50％PEG4000），按常規細胞融合程序進行。用HAT完全培養基做稀釋，培養在事先加有飼養細胞的24孔細胞培養板中，經7天具有雜交瘤細胞增殖，形成有數十個細胞菌落。當對其培養上清液檢查抗體為陽性時，以96孔培養板有限稀釋法和鋼杯法將細胞做克隆化培養和增殖，然后轉入細胞培養瓶中進行常規傳代培養。4．抗體檢測及鑒定(1)ELISA法：HRP標記兔抗鼠Balb/c結合物（北京生物制品研究所購買），用MR580微量ELISA自動讀數儀判讀結果。(2)IF法：直接法用兔抗鼠Balb/cIgG熒光抗體診斷血清對雜交瘤細胞染色，對照用SP2/0細胞，間接法用感染馬傳貧病毒的驢胎皮膚細胞及其正常驢胎皮膚細胞分別載于涂片上丙酮固定后，加A4、A5及C4培養物上清液，置37℃30min，然后用PBS洗滌三次，再用兔抗鼠Balb/cIgG熒光抗體診斷血清，置37℃30min，PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察，并用SP2/0細胞培養物上清做陰性對照。鏡下細胞呈綠色熒光者判為陽性。(3)瓊脂免疫雙擴散法(4)SDS—PAGE法(5)McAb的純化，以雜交瘤細