干擾素制備的工藝流程

李念慈2015140144什么是干擾素？概念(interferon,IFN)：機體免疫細胞產生的一類細胞因子，是機體受到病毒感染時，免疫細胞通過抗病毒應答反應而產生的一組結構類似、功能接近的生物調節蛋白。根據分子結構和抗原性的差異將干擾素分為α、β、γ、ω等4個類型。α干擾素又依其結構分為α1b、α2a、α2b等亞型，其區別在于個別氨基酸的差異上。

早期干擾素是用病毒誘導人白血球產生的，產量低、價格昂貴，不能滿足需要，現在可利用基因工程技術并在大腸桿菌中發酵、表達來進行生產。一、目的基因的分離與獲得1.設計合成干擾素基因的兩端引物（完全的），每條引物內或5‘-端最好有內切酶酶切位點。2.有藥物誘導細胞，如佛波酯，使細胞表達干擾素升高。3.破碎細胞，提取細胞總mRNA.4.用逆轉錄試劑盒逆轉錄，把總mRNA逆轉錄成cDNA5.以cDNA為模板、干擾素引物為引物，PCR，得到完全的干擾素基因的PCR產物二、目的基因與克隆載體進行體外重組1.提取載體（質粒、病毒等），雙酶切，再把干擾素基因的PCR產物用相應的酶酶切，用連接酶連接EcoRIBamHIEcoRIBamHI

2.連接完成后分離純化，測序，與原干擾素序列比對。3.鑒定序列無誤后（無義突變也行），導入受體細胞，篩選三、重組體引入宿主細胞

將cDNA克隆到含有四環素、氨芐青霉素抗性基因的質粒pBR322中，轉化到大腸桿菌，重組的載體DNA分子在一定條件下轉化入大腸桿菌，形成攜帶質粒的菌株。五、提取重組質粒1、對上一步獲得含目的基因的大腸桿菌在含有氯霉素的培養基中擴大培養15h。培養時間：前人實驗證實大腸桿菌K12生長前6h為遲緩期,6~15.5h為對數增時期,15.5~19.5h為穩定期,19.5h后為衰亡期。氯霉素：氯霉素可抑制宿主的蛋白質合成，結果阻止了細菌染色體的復制，然而，松弛型質粒仍可繼續復制。2、細菌的收獲和裂解

１）用合適轉頭于4℃以4000轉/分離心15分鐘，棄上清，敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。

２）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/LTris.Cl(pH8.0)]。當溶液的pH值低于8.0時，溶菌酶不能有效工作。

３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。

溶液Ⅱ:

0.2mol/LNaOH(臨用前用10mol/L貯存液現用現稀釋）

1％SDS

蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數次，以充分混勻內容物。于室溫放置5-10分鐘。４）加15nl(20ml)用冰預冷的溶液Ⅲ。

溶液Ⅲ:

5mol/L乙酸鉀60ml

冰乙酸11.5ml

水28.5ml

６）上清過濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。７）用合適轉頭于室溫以500轉/分離心15分鐘，回收核酸。如于4℃離心，鹽也會了生沉淀。８）小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮殆盡。９）用3mlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀。10）純化。六、質粒DNA的純化

（一）聚乙二醇沉淀法提取質粒ＤＮＡ

１）將核酸溶液所得]轉入15mlＣorex管中，再加3ml用冰預冷的5mol/LLiCl溶液，充分混勻，用合適轉頭于４℃下以10000轉/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。

２）將上清轉移到另一30mlCorex管內，加等量的異丙醇，充分混勻，用SorvallSS34轉頭（或與其相當的轉尖）于室溫以10000轉/分離心10分釧，回收沉淀的核酸。

３）小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使最后殘留的液滴流盡。于室溫用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使最后殘余的痕量乙醇蒸發殆盡。

４）用500μl含無DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml）的TE（pH8.0）溶解沉淀，將溶液轉到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。

５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG8000）的1.6mol/LNaCl,充分混合，用微量離心機于４℃以12000g離心５分鐘，以回收質粒ＤＮＡ。

６）吸出上清，用400μlTE(pH8.0)溶解質粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。

７）將水相轉到另一微量離心管中，加100μl10mol/L乙醇銨，充分混勻，加２倍體積（約1ml）乙醇，于室溫放置10分鐘，于4℃以12000g離心5分鐘，以回收沉淀的質粒ＤＮＡ。

８）吸去上清，加200μl處于4℃以12000g離心2分鐘。

９）吸去上清，敞開管口，將管置于實驗桌上直到最后可見的痕量乙醇蒸發殆盡。

10）用500μlTE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀釋[用TE（pH8.0)]后測量OD260，計算質粒DNA的濃度（1OD260＝50μg質粒DNA/ml），然后將DNA貯于－20℃。七、對重組質粒的檢測與目的基因提取目的基因獲取對獲得的質粒進行雙酶切，獲得目的基因與PBR322質粒片段，通過瓊脂糖凝膠電泳，由于目的基因與PBR322質粒片段相對分子量不同，在電泳過程中產生不同的條帶，通過與已知基因長度的對比，我們可以選出相應的目的基因，接著利用Qiagen純化柱回收純化DNA。具體：用3倍體積的特殊高鹽溶液于55°融化帶有目的基因的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊，將DNA釋放到水溶液中。然后將其通過Qiagen純化柱，經過如圖結合—洗滌—洗脫步驟，直接得到純化的DNA樣品。利用核酸探針雜交法鑒定目的基因八、目的基因與表達載體的組合與導入表達載體：PBV220,，將PBV220和目的基因用雙酶切法處理，退火后連接，構建重組質粒，利用CaCl2法導入到宿主大腸桿菌中，構建工程菌，在培養基中培養，利用干擾素性質鑒定目的工程菌，分離工程菌，擴大培養，提取出質粒，分析質粒穩定性。1．菌種制備

取－70℃下保存的甘油管菌種（工作種子批），于室溫下融化。然后，接入搖瓶，培養溫度30℃，pH7.0，250r/min活化培養18±2小時后，進行吸光值測定和發酵液雜菌檢查。2．種子罐培養

將已活化的菌種接入裝有30L培養基的種子罐中，接種量10%，培養溫度30℃，pH7.0，級聯調節通氣量和攪拌轉速，控制溶解氧為30%，培養3～4小時，轉入發酵罐中，同時取樣發酵液進行顯微鏡檢查和LB培養基劃線檢查，控制雜菌

3.發酵罐培養

將種子液通入300L培養基的發酵罐中，接種量10%，培養溫度30℃，pH7.0。級聯調節通氣量和攪拌轉速，控制溶解氧30%，培養4小時。然后控制培養溫度20℃，pH6.0，溶解氧60%，繼續培養5～6.5小時。同時進行發酵液雜菌檢查，當OD值達9.0±1.0后，用5℃冷卻水快速降溫至15℃以下，以減緩細胞衰老。或者將發酵液轉入收集罐中，加入冰塊使溫度迅速降至10℃以下。4.菌體收集

將已降溫的發酵液轉入連續流離心機，16000r/min離心收集。進行干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質粒結構一致性、質粒穩定性等項目的檢測。菌體于－20℃冰柜中保存時，不得超過12個月。每保存3個月，檢查一次活性。(1)．溶解氧控制分別在生長階段和生產階段采用各自最佳溶解氧濃度，以期提高干擾素的發酵水平。通過級聯調節通氣量和攪拌轉速得以實現。(2).溫度控制假單孢桿菌生長最適溫度與產物形成最適溫度是不同的。產物合成溫度控制在20℃可以有效防止干擾素-α2b的降解，而其最佳生長溫度則為30℃。質粒的穩定性隨溫度的升高而迅速下降，因此在培養后期降溫可以