2023江蘇版生物高考第二輪復習專題27基因工程與蛋白質工程

高頻考點考點1基因工程的工具與操作程序該考點中基礎部分訓練內容為限制酶、DNA連接酶、運載體、PCR技術等.重難、綜合部分為結合具體情境.考查對基因工程工具的理解和應用，目的基因的獲取涉及的PCR相關問題的分析、基因表達載體的構建問題的分析等.基?出5；-GAATT（：-3；（2021湖北,7,2分）限制性內切酶EcoRI識別并切割,-CTTAAf-5雙鏈口附,用EcoRj完全酶切果蠅基因組DNA,理論上得到DNA片段的平均長度（堿基對）約為（）A.6 B.250C.4000 D.24000答案C（2022鹽城阜寧中學三檢,15）熱啟動PCR可提高擴增效率,其基本方法是進行反應之前將Taq酶、dNTP和引物等先不要加入樣品管內,而是將樣品加熱，待溫度升到70C以上時,再停上述試劑加入,開始PCR擴增,下列敘述正確的有（多選）（）A.Taq酶最適催化溫度范圍為50'60'CB.與常規PCR相比,熱啟動PCR可減少反應起始時引物錯配形成的產物C.兩條子鏈合成一定都是從5'端向3'端延伸D.PCR產物DNA堿基序列的特異性體現了Taq酶的特異性答案BC（2022南通質檢一,17）圖1表示大腸桿菌PBR322質粒，圖1、圖2中標注了相關限制酶的酶切位點。下列敘述正確的是（多四環素抗性基因BamYl<BelI選四環素抗性基因BamYl<BelIBam\lIHindHI啟動子氨芳青霉素

抗性基因

BamHI HirjdHlL .]llclI/目的基因圖2A.圖1質粒中含有多個限制酶的酶切位點,不含游離的磷酸基團B.構建重組質粒時若選用BamH1會破壞兩個標記基因,不便于后續的篩選C.構建重組質粒時同時用BelI和HindIII,利于防止目的基因反向連接D.將重組質粒直接轉入處于感受態的酵母菌細胞，可實現其快速擴增答案ABC重難（2021江蘇,13,2分）如圖是剔除轉基因植物中標記基因的一種策略,下列相關敘述錯誤的是（）目的 無篩選標記轉基因植株肺基因農桿菌1 雜交分離只皿’農桿菌2 Vjjj|\S.WGGOI農桿菌2 Vjjj|\S.WGO-*標記基因SMGO~?A.分別帶有目的基因和標記基因的兩個質粒,都帶有T-DNA序列B.該方法建立在高轉化頻率基礎上,標記基因和目的基因須轉到不同染色體上C.若要獲得剔除標記基因的植株,轉化植株必須經過有性繁殖階段遺傳重組D.獲得的無篩選標記轉基因植株發生了染色體結構變異答案D（2021湖北,16,2分）某實驗利用PCR技術獲取目的基因,實驗結果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全配對）外,還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對）.為了減少反應中非特異條帶的產生,以下措施中有效的是（）A.增加模板DMA的量 B.延長熱變性的時間C.延長延伸的時間 D.提高復性的溫度答案D（2021浙江6月選考.20,2分）采用CRISPR/Cas9基因編輯技術可將增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因定點插入受精卵的Y染色體上，獲得轉基因雄性小鼠.該轉基因小鼠與野生型雌性小鼠交配,通過觀察熒光可確定早期胚胎的性別.下列操作錯誤的是（）A.基因編輯處理的受精卵在體外培養時，不同發育階段的胚胎需用不同成分的培養液B.基因編輯處理的受精卵經體外培養至2細胞期，須將其植入同期發情小鼠的子宮,才可獲得表達EGFP的小鼠C.分離能表達EGFP的胚胎干細胞,通過核移植等技術可獲得大量的轉基因小鼠D.通過觀察早期胚胎的熒光,能表達EGFP的即為雄性小鼠胚胎答案B萬口（2022全國乙,38,15分）新冠疫情出現后，病毒核酸檢測和疫苗接種在疫情防控中發揮了重要作用.回答下列問題。⑴新冠病毒是一種RNA病毒,檢測新冠病毒RNA（核酸檢測）可以采取RT-PCR法。這種方法的基本原理是先以病毒RNA為模板合成cDNA,這一過程需要的酶是,再通過PCR技術擴增相應的DNA片段.根據檢測結果判斷被檢測者是否感染新冠病毒。（2）為了確保新冠病毒核酸檢測的準確性,在設計PCR引物時必須依據新冠病毒RNA中的來進行.PCR過程每次循環分為3步,其中溫度最低的一步是.（3）某人同時進行了新冠病毒核酸檢測和抗體檢測（檢測體內是否有新冠病毒抗體），若核酸檢測結果為陰性而抗體檢測結果為陽性,說明（答出1種情況即可）；若核酸檢測和抗體檢測結果均為陽性,說明.（4）常見的病毒疫苗有滅活疫苗、蛋白疫苗和重組疫苗等.已知某種病毒的特異性蛋白S（具有抗原性）的編碼序列（目的基因）.為了制備蛋白疫苗，可以通過基因工程技術獲得大量蛋白S.基因工程的基本操作流程是.答案 （1）逆轉錄酶（2）特定核甘酸序列復性（3）曾經感染過新冠病毒但已康復已感染新冠病毒，還未康復（或為患者）（4）蛋白S基因的獲取一構建蛋白S基因表達載體一導入受體細胞（微生物）一蛋白S基因的檢測與鑒定（檢測受體能否產生蛋白S）（2022廣東,22,12分）“綠水逶迤去，青山相向開”，大力發展低碳經濟已成為全社會的共識.基于某些梭菌的特殊代謝能力,有研究者以某些工業廢氣（含CO等一碳溫室氣體，多來自高污染排放企業）為原料,通過厭氧發酵生產丙酮,構建一種生產高附加值化工產品的新技術.

； 輔酶A 乙酰乙酸、；硫解酶轉移酶脫竣酶學：2x乙ThlA乙酰乙QfAB乙酰Adc丙［：酰CoA 酰CoA 乙酸酮一屆誨血而一回答下列問題：⑴研究者針對每個需要擴增的酶基因（如圖）設計一對,利用PCR技術在優化反應條件后擴增得到目標酶基因。（2）研究者構建了一種表達載體pMTL80k,用于在梭菌中建立多基因組合表達庫，經篩選后提高丙酮的合成量。該載體包括了啟動子、終止子及抗生素抗性基因等,其中抗生素抗性基因的作用是，終止子的作用是.（3）培養過程中發現重組梭菌大量表達上述酶蛋白時，出現了生長遲緩的現象,推測其原因可能是，此外丙酮的積累會傷害細胞,需要進一步優化菌株和工藝才能擴大應用規模。（4）這種生產高附加值化工產品的新技術,實現了，體現了循環經濟特點.從“碳中和”的角度看，該技術的優勢在于,具有廣泛的應用前景和良好的社會效益.答案（1）引物（2）便于篩選含有目的基因的受體細胞使轉錄在所需要的地方停下來（3）酶蛋白的大量合成消耗了大量物質和能量（4）廢棄物的資源化減少了碳排放（2020江蘇,33,8分）如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,簡捷地分析出已知序列兩側的序列,具體流程如圖（以EcoR1酶切為例）:染色體DNAI酶切|竺R忸缺明混合的DNA片段51 .. ..一 ,3,.、未知序列「已知序列I未知序列］片段F環狀DNAPCR弓物EctAXRI擴增|7麗DNA聚合前—=—環狀DNAPCR弓物EctAXRI擴增|7麗DNA聚合前—=—=PCR產物5'.?3'片段F的完整序列請據圖回答問題:（1）步驟I用的EcoRI是一種酶，它通過識別特定的切割特定位點.（2）步驟II用的DNA連接酶催化相鄰核甘酸之間的-羥基與5'-磷酸間形成:PCR循環中,升溫到95℃是為了獲得；TaqDNA聚合酶的作用是催化.（3）若如表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物,步驟III選用的PCR引物必須是（從引物①②③④中選擇,填編號）.DNA序列（虛線處省略了部分核音酸序列）已知5'-AACTATGCGCTCATGA GCAATGCGTAGCCTCT-3'IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

3'-TIGATACGCGACTACT CGTIACGCATC.GGAGA-S'闞①5'-AACTATGCGCTCATGA-3'PCR ②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'引物 ③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'@5,-TCATGAGCGCATAGTT-3'（4）對PCR產物測序,經分析得到了片段F的完整序列.下列DNA單鏈序列中（虛線處省略了部分核苗酸序列），結果正確的是.5'-AACTATGCG AGCCCTT-3"5'-AATTCCATG CTGAATT-3'5'-GCAATGCGT TCGGGAA-3'5'-TTGATACGC CGAGTAC-3'答案 （1）限制性核酸內切（新教材為限制性內切核酸）（或限制）核苜酸序列（2）磷酸二酯鍵DNA單鏈以DNA為模板的DNA鏈的延伸⑶②④（4）B考點2基因工程的應用與蛋白質工程該考點中基礎部分訓練內容為基因工程在農牧業、醫藥衛生、食品工業等方面的應用以及蛋白質工程等;重難、綜合部分為對轉基因生物或產品的生產流程的分析，考直考生運用基因工程的相關知識分析相關事例時的理解與運用能力,以及獲取信息并解決問題的能力.

基礎（2022蘇州期末,19）人參是一種名貴藥材,具有良好的滋補作用.干擾素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。如圖為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細胞的流程.①'④表示相關的操作,EcoRI、BamH1為限制酶，它們的識別序列及切割位點如表所示.下列有關敘述錯誤的是（多選）（）限制酶 識S!l序列及切割位點I

EcoRI

GAATTCIBamHI含干擾素基因的DNA片段EcoRIBamWITi含干擾素基因的DNA片段EcoRIBamWITi質粒農桿建EcoRI8amHI①?①?（*擴增，干擾素EcoRIBamWI啟動子人參愈傷組織細胞篩選］④生因嘉且A根瘤侵染.

標記緊載縱③農桿菌

基因入』止子檢測、

能合成干擾素的人參愈傷組織細胞篩選］④A.過程①所需的兩種引物中分別加上GAATTC和GGATCC序列，有利于后續操作B.構建基因表達載體時,目的基因必須位于啟動子和終止子之間才能進行復制C.過程③利用的是T-DXA的特性將目的基因整合到受體細胞的染色體DNA中D.過程④需控制培養基中植物激素的種類和比例,以防止愈傷組織細胞發生再分化答案BC重難（2021遼寧,14,2分）睛水合酶岫）廣泛應用于環境保護和醫藥原料生產等領域但不耐高溫利用蛋白質工程技術在“的u和P亞基之間加入一段連接肽，可獲得熱穩定的融合型睛水合酶（M）.下列有關敘述錯誤的是（）A.，與:氨基酸序列的差異是影響其熱穩定性的原因之一B.加入連接肽需要通過改造基因實現C.獲得N,的過程需要進行轉錄和翻譯D.檢測N,的活性時先將、與底物充分混合,再置于高溫環境答案D（2020浙江7月選考,24,2分）下列關于基因工程的敘述，正確的是（A.若受體大腸桿菌含有構建重組質粒時用到的限制性核酸內切酶（限制性內切核酸酶），則一定有利于該重組質粒進入受體并保持結構穩定B.抗除草劑基因轉入某抗鹽植物獲得2個穩定遺傳轉基因品系,抗性鑒定為抗除草劑抗鹽和抗除草劑不抗鹽.表明一定是抗鹽性的改變與抗除草劑基因的轉入無關C.抗除草劑基因轉入某植物獲得轉基因植株,其DNA檢測均含目的基因,抗性鑒定為抗除草劑和不抗除草劑.表明一定是前者表達了抗性蛋白而后者只表達抗性基因RNAD.已知不同分子量DNA可分開成不同條帶,相同分子量的為一條帶.用某種限制性核酸內切酶（限制性內切核酸酶）完全酶切環狀質粒后，出現3條帶.表明該質粒上一定至少有3個被該醯切開的位置答案D（2021全國甲,38,15分）PCR技術可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌,醫生進行了相關操作：。汾析PCR擴增結果;②從病人組織樣本中提取DNA;③^用PCR擴增DNA片段;行集病人組織樣本.回答下列問題：（1）若要得到正確的檢測結果，正確的操作順序應該是（用數字序號表示）.（2）操作③中使用的酶是.PCR中的每次循環可分為變性、復性、三步，其中復性的結果是（3）為了做出正確的診斷,PCR所用的引物應該能與 特異性結合.PCR（多聚醐鏈式反應）技術是指.該技術目前被廣泛地應用于疾病診斷等方面.答案 （1）④②③①（2）DNA聚合酶延伸引物通過堿基互補配對與單鏈DNA結合（3）病原菌DNA（4）在生物體外大量快速擴增特定DNA片段的技術綜合（2022湖南,22,15分）水蛭是我國的傳統中藥材，主要藥理成分水蛭素為水姓蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用.擬通過蛋白質工程改造水蛭素結構,提高其抗凝血活性.回答下列問題：⑴蛋白質工程流程如圖所示,物質a是,物質b是.在生產過程中,物質b可能不同,合成的蛋白質空間構象卻相同,原因是—*---預期功能*---預期功能——?生物功能和利用PCR技術和利用PCR技術擴增。PCR技術遵循的基本原理是（3）將提取的水蛭蛋白經甲、乙兩種蛋白酶水解后，分析水解產物中的肽含量及其抗凝血活性，結果如圖所示.推測兩種處理后酶解產物的腱血活性差異主要與肽的（填“種類”或“含量”）有關，導致其活性不同的原因是酶解產物的腱血活性差異主要與肽的酶解時間（h）J-U/SS酶解時間（h）J-U/SS詡加W一胸甲處理。旃乙處理0 2 4 6 8 10酶解時間(h)（4）若要比較蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，簡要寫出實驗設計思路.答案（D多肽鏈mRNAmRNA上決定氨基酸的密碼子具有簡并性（2）從基因文庫中獲取人工合成DNA半保留復制（3）種類醐處理后形成的肽中氨基酸的種類、數目和排列順序不同（4）在相同條件下，將蛋白質工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素分別進行抗凝血實驗,I：檄三組血液凝固所需時間長短，所需時間越長說明其抗凝血活性越大（2021廣東,22,12分）非細胞合成技術是一種運用合成生物學方法,在細胞外構建多酶催化體系，獲得目標產物的新技術，其核心是各種酶基因的挖掘、表達等.中國科學家設計了4步酶促反應的非細胞合成路線（如圖），可直接用淀粉生產肌醇（重要的醫藥食品原料），以期解決高溫強酸水解方法造成的嚴重污染問題,并可以提高產率.a-前聚

糖磷酸

闔化酶

磷酸鹽回答下列問題：（D研究人員采用PCR技術從土壤微生物基因組中擴增得到目標酶基因.此外,獲得酶基因的方法還有.（答出兩種即可）（2）高質量的DNA模板是成功擴增出目的基因的前提條件之一.在制備高質量DNA模板時必須除去蛋白,方法有 .（答出兩種即可）

（3）研究人員使用大腸桿菌BL21作為受體細胞、pET20b為表達載體分別進行4種酶的表達.表達載體轉化大腸桿菌時,首先應制備細胞.為了檢測目的基因是否成功表達出酶蛋白,需要采用的方法有.（4）依圖中所示流程，在一定的溫度、pH等條件下，將4種酶與可溶性淀粉溶液混合組成一個反應體系.若這些酶最適反應條件不同，可能導致的結果是.在分子水平上，可以通過改變,從而改變蛋白質的結構,實現對酶特性的改造和優化.答案 （1）從基因文庫中獲取、用化學方法人工合成（2）蛋白酶水解法、鹽析法、高溫變性法（3）感受態抗原一抗體雜交（4）部分酶失活,無法獲得肌醇基因結構（2021河北,24,15分）采礦污染和不當使用化肥導致重金屬鎘（Cd）在土壤中過量積累。利用植物修復技術將土壤中的Cd富集到植物體內,進行后續處理（例如，收集植物組織器官異地妥善儲存），可隔氐土壤中Cd的含量.為提高植物對Cd污染土壤的修復能力,研究者將酵母液泡Cd轉運蛋白（YCF1）基因導入受試植物,并檢測了相關指標。回答下列問題：（1）為獲取YCF1基因,將酵母細胞的全部DNA提取、切割后與載體連接,導入受體菌的群體中儲存,這個群體稱為.（2）將DNA序列插入Ti質粒構建重組載體時，所需要的兩種酶是.構建的重組基因表達載體中必須含有標記基因,其作用是（3）進行前期研究時,將含有YCF1基因的重組載體導入受試雙子葉植物印度芥菜,采用最多的方法是.研究者進一步獲得了轉YCF1基因的不育楊樹株系,采用不育株系作為實驗材料的目的是.（4）將長勢一致的野生型和轉基因楊樹苗移栽到Cd污染的土壤中,半年后測定植株干重（圖1）及不同器官中Cd含量（圖2）.據圖1可知,與野生型比,轉基因植株對Cd具有更強的（填“耐性”或“富集能力”）；據圖2可知,對轉基因植株的_進行后續處理對于緩解土壤（：d污染最為方便有效.601②40-20-地匕部地下部整株口野生型口轉基因植株601②40-20-地匕部地下部整株（5）已知YCF1特異定位于轉基因植物細胞的液泡膜上.據此分析，轉基因楊樹比野生型能更好地適應高Cd環境的原因是相較于草本植物,采用楊樹這種喬木作為Cd污染土壤修復植物的優勢在于（寫出兩點即可）.答案（1）基因文庫（2）限制酶和DNA連接酶鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來（3）農桿菌轉化法防止YCF1基因隨花粉擴散,給生態系統帶來風險（4）耐性葉（5）轉基因楊樹液泡膜上的Cd轉運蛋白可將細胞質基質中的Cd轉運至液泡貯存，降低Cd對細胞代謝的影響喬木比草本生物量大,與外界物質交換能力強[2021浙江6月選考,29（-）,7分]斑馬魚是一種模式動物,體外受精發育,戚臺透明、便于觀察，可用于水質監測、基因功能分析以及藥物毒性與安全性評價等.（1）人類活動產生的生活污水日益增多,大量未經處理的污水直接排入河流、湖泊會引起水體,導致藻類大量繁殖形成水華.取水樣喂養斑馬魚，可用斑馬魚每周的體重和死亡率等指標監測水體污染程度。（2）為了研究某基因在斑馬魚血管發育過程中的分子調控機制,用DNA連接酶將該基因連接到質粒載體形成,導入大腸桿菌菌株DH5a中.為了能夠連接上該目的基因、并有利于獲得含該目的基因的DH5。陽性細胞克隆，質粒載體應含有（答出2點即可）.提取質粒后,采用法,將該基因導入斑馬魚受精卵細胞中,培養并觀察轉基因斑馬魚胚胎血管的發育情況。（3）為了獲取大量斑馬魚胚胎細胞用于藥物篩選，可用分散斑馬魚囊胚的內細胞團，取分散細胞作為初始材料進行一培養.培養瓶中添加成纖維細胞作為，以提高斑馬魚胚胎細胞克隆的形成率.答案 （1）富營養化（2）重組DNA分子限制性核酸內切酶（限制性內切核酸酶）的識別序列、抗生素抗性基因顯微注射（3）胰蛋白酶原代飼養層細胞考點3生物技術的安全性及DNA的粗提取與鑒定該考點中基礎部分訓練內容主要為DNA的粗提取與鑒定;重難、綜合部分訓練內容主要為對DNA的粗提取與鑒定的深入考查及對生物產品引發安全性問題的思考.基礎（2022南通如皋一模.8）下列有關“DNA粗提取與鑒定”實驗的敘述,正確的是（）A.植物材料需先用洗滌劑破壞細胞壁再吸水破裂，釋放DNAB.在新鮮雞血中加入適量的檸檬酸鈉,混合均勻后離心取上清液C.在含有DNA的2mol/L的氯化鈉溶液中加入蒸儲水,攪拌出現絲狀物后停止加水D.鑒定DNA時,將絲狀物溶解于2mol/L的NaCl溶液中,再加入二苯胺試劑進行沸水浴答案D（2021山東,13,2分）粗提取DNA時，向雞血細胞液中加入一定量的蒸儲水并攪拌,過濾后所得濾液進行下列處理后再進行過濾,在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對含量較高的白色絲狀物的處理方式是（）A.加入適量的木瓜蛋白醒37'40C的水浴箱中保溫1015分鐘C.加入與濾液體積相等的、體積分數為95舟的冷卻的酒精D.加入NaCl調節濃度至2mol/Lf過濾一調節濾液中NaCl濃度至0.14mol/L答案A重難（2022無錫期末,II）我國科研人員在實驗室中通過構建多種酶催化體系的方法,首次實現了在細胞外從二氧化碳固定到合成淀粉的過程.下列有關敘述錯誤的是（）A.可采用PCR技術從不同物種的基因組中擴增得到多酶催化體系中的目標酶基因B.在多酶催化體系中,可能會因為酶的最適反應條件不同而使反應中斷C.該方法可在分子水平上直接改變氨基酸的序列,實現對酶特性的改造和優化D.若該科研成果成熟后推廣應用,有助于擺脫耕順口自然環境限制,解決糧食危機答案C（2021南京、鹽城一模,13）下列有關“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，正確的是（）A.用蒸儲水使家兔成熟的紅細胞破裂,可獲取富含DNA的濾液B.植物材料需先用洗滌劑破壞細胞壁再吸水破裂，釋放DXADNA不溶于體積分數為95%的冷酒精，但可溶于2mol/L的NaCl溶液D.鑒定DNA時,應將絲狀物直接加到二苯胺試劑中并進行沸水浴答案C綜合（2021北京,14,2分）社會上流傳著一些與生物有關的說法,有些有一定的科學依據,有些違反生物學原理。以下說法中有科學依據的是（）A.長時間燉煮會破壞食物中的一些維生素B.轉基因抗蟲棉能殺死害蟲就一定對人有毒C.消毒液能殺菌,可用來清除人體內新冠病毒D.如果孩子的血型和父母都不一樣,肯定不是親生的答案A（2022南通質檢一,18）某科研團隊運用CRISPR/Cas9基因編輯技術,進行了基因編輯活動。該技術的原理是通過設計向導RNA中的識別序列,引導核酸酶Cas9到一個特定的基因位點進行切割（如圖）.下列有關敘述正確的是（多選）（）

(X鏈Cas9蛋白目標(X鏈1n111□if1111識別序列 ：1撲向導RNA■■ .mt-目標DNAA.向導RNA可在RNA聚合酶催化下,以核糖核甘酸為原料合成B.向導RNA中的識別序列可與目標DNA單鏈特定區域進行堿基互補配對C.Cas9蛋白的作用是破壞DNA特定位點脫氧核甘酸之間的氫鍵D.該技術由于存在脫靶等風險,可能會帶來一系列安全及倫理問題答案ABD（2021南通如皋期末,17）為了提取棉花葉綠體DNA,研究人員的下列做法，正確的是（多選）（）A.選取葉肉細胞作為提取葉綠體DNA的實驗材料將細胞置于蒸儲水中,可以使細胞吸水破裂釋放葉綠體C.采用差速離心法去除核物質時,轉速小于獲得葉綠體的轉速D.整個實驗過程置于低溫條件下，可以防止DNA的降解答案ACD題型模板模型一限制酶的選擇典型模型模型限制險選擇的基本原則模型特征:基因工程的試題往往會考查限制酶的選擇,做題時要結合目的基因和質粒綜合考慮選擇哪些限制酶.（2021遼寧,24節選,3分）PHB2蛋白具有抑制細胞增殖的作用。為初步探究某動物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細胞增殖的原因，研究者從基因數據庫中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡稱Phb2基因），大小為0.9kb（1kb=l000堿基對），利用大腸桿菌表達該蛋白。回答下列問題：圖1為所用載體圖譜示意圖,圖中限制酶的識別序列及切割位點見表.為使Phb2基因（該基因序列不含圖1中限制酶的識別序列）與載體正確連接,在擴增的Phb2基因兩端分別引入和兩種不同限制酶的識別序列.經過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進行連接時,可選用（填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”）.

相關限制酶的識別序列及切割位點名稱識別序列及切割位點名稱識別序列及切割位點Hind111AgcttTTCGAA4EcoRIgAattcCTTAAG4PvunCACtTCGTCGAC4Pst1ctgAcGACCTCKpnI而ACCCCATGG?HamW1CGATCCCCTACG注:箭頭表示切割位點圖1圖1答案Pvu11EcoRIT4DNA連接酶（2022浙江百校聯盟聯考,37節選）鈣依賴蛋白激酶（CDPK）在植物的信號傳導和提高植物抗性方面發揮著重要作用。科學家通過將CDPK基因導入擬南芥（雙子葉植物）中,來獲得具有抗性的新品種。如圖為某種質粒表達載體和含CDPK基因的DNA片段示意圖,圖中標記了限制酶的切割位點.據此回答下列問題：卡那霉素抗性基因SmaIEcoRIHindHIXbaICDPK基因通過基因工程，將CDPK基因導入擬南芥中，獲得具有抗性的新品種的育種原理是.為了使CDPK基因插入質粒中,應選取（兩種限制酶）分別切割質粒和含目的基因的DNA片段,不選取另兩種限制酶的理由.答案 基因重組SmaI和XbaIHindIH可切斷目的基因（CDPK基因），EcoRI可切斷標記基因（卡那霉素抗性基因）變式模型變式特殊情況下的限制能選擇模型特征:在某些特殊情況下,如載體^口目的基因上的限制酶不同時，可以考慮選擇同尾酶(識別序列不同但切出的DNA片段具有相同的黏性末端)；質粒和目的基因都能進行轉錄,且轉錄方向是確定的,在將目的基因插入質粒時，要考慮選擇哪種限制酶才能使二者的轉錄方向一致。(2021山東,25,12分)人類丫基因啟動子上游的調控序列中含有BCL11A蛋白結合位點，該位點結合BCLUA蛋白后，丫基因的表達被抑制。通過改變該結合位點的序列，解除對Y基因表達的抑制，可對某種地中海貧血癥進行基因治療.科研人員擴增了Y基因上游不同長度的片段,將這些片段分別插入表達載體中進行轉化?口熒光檢測,以確定BCL11A蛋白結合位點的具體位置.相關信息如圖所示.調控序列及啟動子 Ry基因—L;MHF2J［污Mun1初燃部終止子熒光蛋白基因P基因-I ,CWNhe\EroRIMunIEcnHIXhoI終止子注：F1~F7、R:引物P:雌激索誘導下發揮作用的啟動子限制酶識別序列及切割位點：MunI：CAATTGI iXhoI：CTCCAGEcoRI:CAATTC

i ISalI：GTCGACNheI：GCTAGC(1)為將擴增后的產物定向插入載體指導熒光蛋白基因表達,需在引物末端添加限制酶識別序列。據圖可知,在n'F7末端添加的序列所對應的限制酶是,在R末端添加的序列所對應的限制酶是.本實驗中,從產物擴增到載體構建完成的整個過程共需要種酶。(2)將構建的載體導入除去BCL11A基因的受體細胞,成功轉化后,含FrF6與R擴增產物的載體表達熒光蛋白，受體細胞有熒光,含F7與R擴增產物的受體細胞無熒光.含F7與R擴增產物的受體細胞無熒光的原因是.(3)向培養液中添加適量的雌激素,含F1~F4與R擴增產物的受體細胞不再有熒光,而含F5“F6與R擴增產物的受體細胞仍有熒光.若Y基因上游調控序列上與引物序列所對應的位置不含有BCL11A蛋白的結合位點序列，據此結果可推測,BCLUA蛋白結合位點位于,理由是—答案(l)SalIEcoRI6(2)F7與R擴增產物不含完整的啟動子，熒光蛋白基因不表達(3)引物F4與F5在調控序列上所對應序列之間的區段上根據有無熒光情況判斷,Fl'F4與R擴增產物上均有結合位點,因此結合位點位于F4所對應調控序列的下游（右側）；F5'F6與R擴增產物上均無結合位點，可知結合位點位于F5所對應調控序列的上游（左側），所以結合位點位于引物F4與F5在調控序列上所對應序列之間的區段上模型二PCR技術及應用典型模型模型PCR技術模型特征:基因工程中,PCR技術是獲取和擴增目的基因的重要手段,PCR技術的條件、步驟及結果是最常見的命題落腳點.（2022南通如皋中學階段考,19）農桿菌Ti質粒上的T-DNA可以轉移并隨機插入被侵染植物的染色體DNA上.研究者將如圖中被侵染植物的DNA片段連接成環,并以此環為模板,利用PCK技術擴增出T-DNA插入位置兩側的未知序列,以此可確定T-DNA插入的具體位置.下列說法正確的是（多選）（）,未了序列引鄴I）T-yNA引蟀未”序列'限制酶切點漏③引蕩④限制酶切點

注：子鏈從引物的3,端開始延伸A.進行PCR擴增的依據是DNA分子雙鏈復制的原理B.進行PCR擴增需要的酶有解旋酶和熱穩定的DNA聚合酶C.利用圖中的引物②、③組合可擴增出兩側的未知序列D.通過與受體細胞的基因組序列比對,可確定T-DNA的插入位置答案AD（2022山東濟南十一校聯考,15）為減少引物與模板之間的非特異性配對，人們在常規PCR技術的基礎上進行了改良,發明了巢式PCR技術.其原理是利用兩套PCR引物進行兩輪PCR擴增,首先利用第一對引物（外引物）對目的基因所在DNA進行15~30個循環的擴增;第二輪擴增以第一輪擴增產物為模板,利用第二對引物（內引物或巢式引物）進行15'30個循環的擴增，具體過程如圖所示.下列敘述錯誤的是（）目的基因TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"=> ， A S模板DNA使用外引物進行 *==第一次PCR擴增=>中間產物

使用內引物進行 ?第二次PCR擴增目標產物 ‘ 'A.巢式PCR中加入的組分與常規PCR相同，但擴增產物比常規PCR特異性更強

B.兩套引物需進行兩次PCR,由于和兩套引物都互補的靶序列較少,因此大大提高了擴增的特異性C.內引物擴增的模板是外引物擴增后的產物,第二階段反應能否進行,也是對第一階段反應正確性的鑒定D.如果第一次擴增產生了錯誤片斷,則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率將會增加答案D變式模型變式1定點突變技術模型特征:定點突變是指通過PCR等方法向目的DNA片段中引入所需變化，包括堿基的添加、刪除、點突變等.常用的技術手段有重疊延伸PCR技術.大引物PCR技術等.（2022江蘇百校聯考.18）重疊延伸PCR技術是一種通過寡聚核甘酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板，經過多次PCR擴增，獲得目的基因的方法。該技術在擴增較長片段的DNA、不同來源的DNA片段拼接、基因的定點誘變等方面具有廣泛的應用前景,如圖表示利用重疊延伸PCR技術擴增某目的基因的過程.下列敘述正確的是（多選）（）引物1引物3引物2引物1引物2引物1二目的基因11引物2引物1引物2引物1二目的基因11?I施4第二階段第三階段弓您!!!i加弓弓弓,3根弓I引物4目的基因A.引物中G+C的含量越高,引物與模板DNA結合的穩定性越高B.在第一階段由于引物2和引物3發生堿基互補配對,因此兩者置于不同反應系統中C.引物1、2組成的反應系統和引物3、4組成的反應系統中均進行一次復制后,共產生4種雙鏈DNA分子D.在引物1、2組成的反應系統中,經第一階段要形成圖示雙鏈DNA,至少要經過3次復制答案AB變式2熒光定量PCR技術模型特征:熒光定量PCR技術是指在PCR體系中每加入一對引物的同時加入一個與某條模板鏈互補的熒光探針,當耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處時,會水解探針,使熒光監測系統接收到熒光信號,即每擴增一次，就有一個熒光分子生成.（2022湖北應城一高一模,15）熒光定量PCR技術可定量檢測樣本中某種DNA含量,其原理是在PCR體系中每加入一對引物的同時加入一個與某條模板鏈互補的熒光探針,當耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處時,會水解探針，使熒光監測系統接收到熒光信號,即每擴增一次,就有一個熒光分子生成,過程如圖所示.下列相關敘述錯誤的是（）A.引物與探針均具特異性,與模板結合時遵循堿基互補配對原則B.反應最終的熒光強度與起始狀態模板DNA含量呈正相關C.若用cDXA作模板,上述技術也可檢測某基因的轉錄水平D.耐高溫的DNA聚合前催化DNA的合成總是從子鏈的3'端向5'端延伸的答案D情境應用簡單情境.靶向基因敲除技術（2022南京三模，13）如圖是一種靶向基因敲除技術即TALEN技術.該技術的敲除工具是由DNA識別域TALE和非特異性內切核酸酶FoKI兩個部分組成的蛋白質.TALE的二連氨基酸（字母義I、G、H、D分別代表一種氨基酸）與四種堿基（A、G、C、T）有恒定的對應關系.FoKI是一種形成二聚體后具有內切核酸酶活性的蛋白單體.下列相關敘述錯誤的是（）TAIE蛋白左臂TALE看白右臂A.單獨使用FoKI對基因的切割敲除具有隨機性B.TALE蛋白的合成通常涉及PCR技術和蛋白質工程C.二連氨基酸能與四種含氮堿基發生恒定的堿基互補配對D.TALE蛋白左右臂的二連氨基酸序列的設計依據靶基因堿基序列答案C2.甲醇酵母菌（2022揚州中學3月月考.13）甲醇酵母菌是基因工程中常用的受體菌,它可以高效表達外源蛋白,但自身蛋白分泌到培養基的較少。研究人員將人的膠原蛋白基因導入甲醇酵母中并成功表達.下列有關敘述錯誤的是（）A.用兩種酶切割目的基因和質粒,可防止目的基因反向連接和質粒的自身環化B.常用顯微注射法將膠原蛋白基因導入甲醇酵母中C.與大腸桿菌相比，甲醇酵母作受體菌所表達出的膠原蛋白與人體產生的膠原蛋白結構更相近D.與其他酵母菌相比,甲醇酵母作受體菌便于表達出的膠原蛋白的分離與純化答案B復雜情境3.Cre/loxP重組酶系統(2022泰州泰興中學4月考,24)Cre/loxP重組酶系統是對轉基因受體細胞DNA上的特定序列進行定點切割和重新連接,從而在基因或染色體水平上對生物基因進行遺傳改造的一種技術.請回答下列問題：.②—5'—ATAACITCGTATA—ATCTATGCTATACCAMTITATT3'—TATTCAAfXATAT—TACATACC-ATATCCTTCAATA—5圖1待敲除解P篡國loxP 片段1字黑；圖2⑴loxP具有方向性，結構如圖1所示,其中決定方向的序列是(填序號).(2)Cre酶能催化如圖2所示的反應,隨機識別DNA分子上同向排列的兩個相同的loxP序列,并在圖1的②中特定位點切斷DNA雙鏈,切口被重新連接后,保留片段,從而實現目標基因的敲除。若經Cr<<酶作用使得兩個loxP位點間的序列發生反轉,順因可能是.(3)Cre/loxP重組酶系統可以調控基因的表達，在目的基因(填“上游”或“下游”)插入一個帶有loxP位點的編碼終止密碼子的序列，在Cre酶存在的情況下,目的基因(填“表達”或“不表達”).(4)抗蟲煙草的制備過程中,通常用法將重組質粒導入煙草細胞，導入成功后,標記基因如抗除草劑基因可用Cre/loxP重組酶系統將其,其繼續留在煙草體內可能會將抗除草劑基因轉移到雜草中,造成基因污染.(5)GUS基因編碼的酶可將無色底物生成藍色產物,GFP基因會產生綠色熒光蛋白,配合Cre/loxP重組酶系統來研究發育生物學的問題.圖3

①構建基因表達載體時，可用酶將loxP序列、GUS基因及GFP基因連接,接上35S啟動子之后可在組織中檢測出藍色區而無綠色熒光區（如圖3所示），這是由于基因自身無啟動子而無法表達。②Cre基因經38°C熱處理后可被激活表達,在此前提下組織中可檢測出綠色熒光區,據此分析綠色熒光區形成的原因是，采用等手段可以擴大組織中綠色熒光區的面積。答案 （1）②（2）2兩個loxP序列方向相反（3）上游表達（4）農桿菌轉化敲除（5）①限制酶和DM連接GFP②Cre酶能（特異性識別并）切割loxP序列，使GFP基因得以表達延長熱處理時間4.實時熒光RT-PCR技術（2022江蘇新高考基地4月聯考,6）實時熒光RT-PCR技術（RT-qPCR）利用熒光標記探針對擴增產物量進行實時跟蹤,再根據擴增曲線計算出起始模板量,即樣本病毒載量。如圖是利用RT-qPCR進行新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）載量測定的主要過程.請據圖回答:樣本采集及

病毒滅活處理步驟1:病毒RNA提取wll熒學測/步驟1:病毒RNA提取wll熒學測/

白陶K、RNA、|/丹中./

酶抑制劑）-R-友中-熒九zIs-?步驟2：病毒eDNA合成 3,病毒RNA②酶N、引物、,$，tdNTP等延伸［如引物MRNA-DNA酶X、引物,③<INTP,熒光探針等步驟3：qPCH雜交分子（1）過程①中,RNA提取裂解液可同時滅活病毒,原因是.采集到的樣本要迅速進行病毒滅活處理,其目的是.RNA酶抑制劑的作用是.（2）過程②中,加入的酶N是.根據圖示，保證病毒核酸檢測準確的關鍵是,（3）在進行新冠病毒核酸檢測時,通常以病毒的ORF1ab基因為檢測的目標基因,是因為ORFlab基因具有的特點.檢測試劑中還加有“陽性對照”和“陰性對照”，陰性對照的主要作用是<（4）如表是SARS-CoV-2核酸檢測時PCR儀參數設定要求:步驟)0時間循環a.病毒cDNA合成50C15min1b.預變性95'C5min1C.變性95C5sd.?60,C40s45①步驟a的反應時間要足夠長，其目的是.②步驟d主要包括PCR過程的階段.⑸臨床上，將癥狀及影像學結果高度疑似、核酸多次檢測為“陰性”的現象稱為檢測結果“假陰性”，導致“假陰性”結果可能是由于（填序號）①檢測者處于感染初期②檢測者感染時間較長③樣本采集位置不規范④樣品稀釋度不足⑤病毒出現變異答案（1）蛋白酶K能催化病毒蛋白質水解提高樣本轉運和檢測階段的安全性防止樣本RNA水解,影響檢測結果的準確性（2）逆轉錄酶設