紫杉醇：抗癌藥物明星5000-6000元/克藥源植物：紅豆杉；明星紫杉醇：抗癌藥物明星5000-6000元/克藥源植物：紅豆杉1紅豆杉（Taxus）紅豆杉（Taxus）2紅豆杉種類：全世界11種（北半球）。我國4種一變種：東北紅豆杉、（中國）紅豆杉、云南紅豆杉、喜馬拉雅紅豆杉（西藏紅豆杉）、南方紅豆杉（中國紅豆杉的變種紫杉醇含量：干樹皮重0.01%（萬分之一）數(shù)量：稀少，散生、不成林生長：極為緩慢，50-70年成樹紫杉醇：資源稀缺紅豆杉種類：全世界11種（北半球）。紫杉醇：資源稀缺3云南紅豆杉東北紅豆杉中國紅豆杉南方紅豆杉雜種紅豆杉云南紅豆杉東北紅豆杉中國紅豆杉南方紅豆杉雜種紅豆杉4——對細胞系進行持續(xù)選擇：細胞系在培養(yǎng)工程中，細胞系會出現(xiàn)變異，通過持續(xù)選擇，有可能不斷提高細胞系的生產(chǎn)能力。大量的試驗證實了這一點。云南紅豆杉細胞系黃白色細胞深褐色細胞顏色含水量生長速度分泌物質(zhì)——對細胞系進行持續(xù)選擇：細胞系在培養(yǎng)工程中，細胞系會出現(xiàn)5云南紅豆杉細胞系統(tǒng)選擇的結(jié)果云南紅豆杉細胞系統(tǒng)選擇的結(jié)果6植物種類代謝物整株植物（%）細胞培養(yǎng)物（%）長春花長春堿0.00170.005長春花蛇根堿——2.0栗米草莽草酸——10紫草紫草素1-215-20人參人參皂甙0.52.2黃連小檗堿2-413.4洋紫蘇迷迭香酸3.016云南紅豆杉紫杉醇0.020.11中國紅豆杉紫杉烷(Sinenxan)微量7-11=1500mg/L植物種類代謝物整株植物（%）細胞培養(yǎng)物（%）長春花長春堿0.7SinenxanA：R=AcSinenxanB：R=CH3CH2COSinenxanC：R=CH3CH2CH(CH3)CO紫杉烷BaccatinIII的結(jié)構(gòu)（紫杉醇的母核）紫杉烷Sinenxan的結(jié)構(gòu)

紫杉醇TaxolSinenxanA：R=Ac紫杉烷Baccati8——細胞誘變選擇細胞系：如Deus用X射線處理長春花細胞，獲得了蛇根堿含量達2%的細胞系；Berlin等用化學(xué)誘變煙草細胞，獲得了生產(chǎn)肉桂酰腐胺能力提高了10倍的細胞系。——細胞系遺傳改良：利用基因工程技術(shù)超量表達限速酶基因、阻斷分支代謝基因表達，從而提高細胞系合成次生代謝產(chǎn)物能力。代謝工程——細胞誘變選擇細胞系：如Deus用X射線處理長春花細胞，獲9（2）優(yōu)化培養(yǎng)基

（次生代謝物的產(chǎn)量=細胞生長量×細胞合成代謝物的能力）基本培養(yǎng)基細胞產(chǎn)量(gDW/L)蛇根堿(mg/L)蛇根堿含量（%DW）Blaydes7.64.40.06LS9.300MS8.910.40.12N-N2.32.00.09VM5.000White

0.800B5

5.100B5+2,4-D1mg/L14.60.50.01B5+2,4D2mg/L5.200B5+NAA1.86mg/L7.61.20.02Heller+IAA0.175+BA1.13mg/L5.46.60.12（2）優(yōu)化培養(yǎng)基（次生代謝物的產(chǎn)量=細胞生長量×細胞合成代10——基本培養(yǎng)基：不同的基本培養(yǎng)基對細胞生長和次生代謝物的合成影響很大。基本培養(yǎng)基中N和P的濃度高往往有利于生長，但不利于次生代謝物的合成。——植物激素：植物激素對次生代謝物生產(chǎn)的影響非常復(fù)雜。一般2,4-D促進細胞生長，但抑制代謝物的合成。如在有2,4-D存在時，長春花、蔓陀蘿、天仙子、罌粟等細胞不能合成生物堿，雞眼藤不能合成蒽醌。紫草細胞培養(yǎng)時，IAA能促進紫草素的合成，而NAA，2,4-D則抑制其形成。但高濃度的2,4-D卻能促進煙草中泛醌-10的合成。

——基本培養(yǎng)基：不同的基本培養(yǎng)基對細胞生長和次生代謝物的合成11

（3）

飼喂前體物質(zhì)（precursor）藥物有效成分生物合成途徑中的中間物質(zhì)。添加前體物質(zhì)是提高次生代謝物產(chǎn)量的一個有效方法。如紫杉醇（Taxol）：

紫杉醇結(jié)構(gòu)可以分為母核（baccatinIII）和側(cè)鏈2部分,側(cè)鏈則是由苯丙氨酸與苯甲酸形成的；BaccatinIII是二萜類化合物，而二萜類化合物的生物合成途徑已經(jīng)基本明確。（3）飼喂前體物質(zhì)（precursor）藥物有效成分生物12紫杉二烯單萜化合物C10倍半萜化合物C15其它二萜化合物異戊二烯乙酰輔酶A牻牛兒醇法呢兒醇牻牛兒醇基牻牛兒醇紫杉二烯單萜化合物C10倍半萜化合物C15其它二萜化合物異戊13試驗證明，向培養(yǎng)基中添加紫杉醇合成的前提物質(zhì)（牻牛兒醇、牻牛兒醇基牻牛兒醇苯甲酸、苯丙氨酸等）可以使紅豆杉細胞中紫杉醇含量提高3-5倍；

向鬼臼細胞培養(yǎng)基中添加前提物質(zhì)使鬼臼毒素含量提高12倍。

試驗證明，向培養(yǎng)基中添加紫杉醇合成的前提物質(zhì)（牻牛14（4）使用誘導(dǎo)子（elicitor）誘導(dǎo)子是指能刺激細胞合成次生代謝產(chǎn)物的物質(zhì)。誘導(dǎo)子分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子。生物誘導(dǎo)子是指微生物，特別是致病微生物（活菌、高溫滅菌后的菌物或其勻漿物）、微生物多糖等；非生物誘導(dǎo)子是指重金屬離子（Ag+,V2+,Hg2+,Cu2+）或Ca2+等。誘導(dǎo)子一般是在細胞培養(yǎng)的中后期（接近細胞最大生長期）加入。

（4）使用誘導(dǎo)子（elicitor）誘導(dǎo)子是指能刺激細胞合15植物生物技術(shù)在生物制藥中的作用課件16化合物植物細胞誘導(dǎo)前產(chǎn)量誘導(dǎo)后產(chǎn)量生物堿罌粟2.9mg/L78mg/L黃酮蕓香0.01mg/L0.5mg/L棉酚棉花2.0mg/L200mg/L皂素薯蕷130mg/L230mg/L紫杉醇紅豆杉2.5mg/L5.5mg/L化合物植物細胞誘導(dǎo)前產(chǎn)量誘導(dǎo)后產(chǎn)量生物堿罌粟2.9mg/L17（5）改善培養(yǎng)條件光照：光照可以刺激長春花細胞合成蛇根堿、銀杏細胞合成黃酮，卻抑制黃連細胞中小檗堿、紅豆杉細胞中紫杉醇的合成溫度：長春花和駱駝蓬細胞的最佳生長溫度分別是27℃和30℃，但合成生物堿的最佳溫度是分別是16℃和25℃。但胡蘿卜在25℃和28℃時細胞合成花色素的能力無差異。PH值：雷公藤細胞合成雷公藤素乙的能力在pH6.0時最強；番薯細胞合成色醇的能力在pH6.3時最大，在pH4.8時則不能合成；胡蘿卜細胞合成花色素的能力在pH4.5時最強，提高pH值則導(dǎo)致合成能力下降。

（5）改善培養(yǎng)條件光照：光照可以刺激長春花細胞合成蛇根堿、18（6）改進培養(yǎng)方法——兩步培養(yǎng)法：細胞生長與有效成分合成所需要的條件往往不同、不同步，有效成分的合成與積累落后于生長。在前期促進細胞生長，在后期促進合成，從而兼顧細胞的生長量和次生代謝物的合成，達到提次生代謝物產(chǎn)量的目的。（6）改進培養(yǎng)方法——兩步培養(yǎng)法：19云南紅豆杉細胞生長與紫杉醇含量動態(tài)紫杉醇含量生長量云南紅豆杉細胞生長與紫杉醇含量動態(tài)紫杉醇含量生長量20植物生物技術(shù)在生物制藥中的作用課件21——兩相培養(yǎng)法：根據(jù)化學(xué)反應(yīng)平衡原理知道，產(chǎn)物的積累會抑制化學(xué)反應(yīng)正方向的速度（反饋調(diào)節(jié)），還可能會對細胞生長有毒害；移去產(chǎn)物則可以促進化學(xué)反應(yīng)朝正方向進行。因此，如果將產(chǎn)物富集起來、與細胞體系相對隔離，就有利于產(chǎn)物的合成。兩相培養(yǎng)可以解決這個問題。——兩相培養(yǎng)法：22兩相培養(yǎng)法有2種方式。液—固培養(yǎng):液相是細胞和液體培養(yǎng)基，固相是能吸收藥物成分的物質(zhì)，如樹脂、活性炭等。液-液培養(yǎng):一層液相是細胞和液體培養(yǎng)基，另一層液相是能溶解次生代謝物的有機溶劑（如乙酸乙酯）。這2種方法都可以減少培養(yǎng)基中有效成分濃度，防止負反饋調(diào)節(jié)，從而提高代謝物的產(chǎn)量。香竺葵細胞兩相培養(yǎng)（液-液培養(yǎng)）：倍半萜的產(chǎn)量提高了500倍。

兩相培養(yǎng)法有2種方式。23土壤農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，在自然界中普遍存在，其特點是能感染雙子葉植物，并引起植物形成腫瘤。三、植物基因工程與生物制藥植物基因工程：

把外源基因?qū)胫参锛毎@得能表達外源基因的植株，從而改變植物的性狀。1983年第一個轉(zhuǎn)基因植物—轉(zhuǎn)基因煙草土壤農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefacien24根癌農(nóng)桿菌引起的植物腫瘤根癌農(nóng)桿菌引起的植物腫瘤25農(nóng)桿菌含有Ti質(zhì)粒,Ti質(zhì)粒中有一端可以轉(zhuǎn)移的DNA(transferDNA,T-DNA),T-DNA含有生長素和細胞分裂素合成酶基因。農(nóng)桿菌可以把T-DNA轉(zhuǎn)到植物細胞的染色體上(基因組DNA)，生長素和細胞分裂素合成酶基因表達提高了細胞中生長素和細胞分裂素含量,促進細胞分裂,形成腫瘤。Ti質(zhì)粒T-DNA農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌含有Ti質(zhì)粒,Ti質(zhì)粒中有一端可以轉(zhuǎn)移的D26第一步：獲得目的基因、構(gòu)建基因表達盒基因表達盒的結(jié)構(gòu)為：

終止子目的基因植物基因表達的結(jié)構(gòu)啟動子CaMV35S基因的polyA;農(nóng)桿菌胭脂堿基因的Tnos原核生物和真核生物的啟動子植物基因工程的步驟第一步：獲得目的基因、構(gòu)建基因表達盒終止子目的基因植物基因表2735S啟動子控制的GUS基因在煙草中表達莖葉片橫切面根花幼苗啟動子：位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游、能夠指導(dǎo)RNA聚合酶同模板正確結(jié)合、啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。

組成型啟動子：在所有細胞、組織、器官中持續(xù)發(fā)揮作用的啟動子。常用的有花椰菜花葉病毒35S啟動子（CaM35S）、植物看家基因（actin基因、Ubiquitin基因等）啟動子。35S啟動子控制的GUS基因在煙草中表達莖葉片橫切面根花幼28特異啟動子：只在特定的組織或者器官（根、葉片、花器官、花粉、種子等）中起作用的啟動子擬南芥pyk10根啟動子特異啟動子：只在特定的組織或者器官（根、葉片、花器官、花粉、29水稻胚乳特異啟動子QuLQetal.J.Exp.Bot.2008;59:2417-2424?2008TheAuthor(s).水稻胚乳特異啟動子QuLQetal.J.Exp.30紫杉醇：抗癌藥物明星5000-6000元/克藥源植物：紅豆杉；明星紫杉醇：抗癌藥物明星5000-6000元/克藥源植物：紅豆杉31紅豆杉（Taxus）紅豆杉（Taxus）32紅豆杉種類：全世界11種（北半球）。我國4種一變種：東北紅豆杉、（中國）紅豆杉、云南紅豆杉、喜馬拉雅紅豆杉（西藏紅豆杉）、南方紅豆杉（中國紅豆杉的變種紫杉醇含量：干樹皮重0.01%（萬分之一）數(shù)量：稀少，散生、不成林生長：極為緩慢，50-70年成樹紫杉醇：資源稀缺紅豆杉種類：全世界11種（北半球）。紫杉醇：資源稀缺33云南紅豆杉東北紅豆杉中國紅豆杉南方紅豆杉雜種紅豆杉云南紅豆杉東北紅豆杉中國紅豆杉南方紅豆杉雜種紅豆杉34——對細胞系進行持續(xù)選擇：細胞系在培養(yǎng)工程中，細胞系會出現(xiàn)變異，通過持續(xù)選擇，有可能不斷提高細胞系的生產(chǎn)能力。大量的試驗證實了這一點。云南紅豆杉細胞系黃白色細胞深褐色細胞顏色含水量生長速度分泌物質(zhì)——對細胞系進行持續(xù)選擇：細胞系在培養(yǎng)工程中，細胞系會出現(xiàn)35云南紅豆杉細胞系統(tǒng)選擇的結(jié)果云南紅豆杉細胞系統(tǒng)選擇的結(jié)果36植物種類代謝物整株植物（%）細胞培養(yǎng)物（%）長春花長春堿0.00170.005長春花蛇根堿——2.0栗米草莽草酸——10紫草紫草素1-215-20人參人參皂甙0.52.2黃連小檗堿2-413.4洋紫蘇迷迭香酸3.016云南紅豆杉紫杉醇0.020.11中國紅豆杉紫杉烷(Sinenxan)微量7-11=1500mg/L植物種類代謝物整株植物（%）細胞培養(yǎng)物（%）長春花長春堿0.37SinenxanA：R=AcSinenxanB：R=CH3CH2COSinenxanC：R=CH3CH2CH(CH3)CO紫杉烷BaccatinIII的結(jié)構(gòu)（紫杉醇的母核）紫杉烷Sinenxan的結(jié)構(gòu)

紫杉醇TaxolSinenxanA：R=Ac紫杉烷Baccati38——細胞誘變選擇細胞系：如Deus用X射線處理長春花細胞，獲得了蛇根堿含量達2%的細胞系；Berlin等用化學(xué)誘變煙草細胞，獲得了生產(chǎn)肉桂酰腐胺能力提高了10倍的細胞系。——細胞系遺傳改良：利用基因工程技術(shù)超量表達限速酶基因、阻斷分支代謝基因表達，從而提高細胞系合成次生代謝產(chǎn)物能力。代謝工程——細胞誘變選擇細胞系：如Deus用X射線處理長春花細胞，獲39（2）優(yōu)化培養(yǎng)基

（次生代謝物的產(chǎn)量=細胞生長量×細胞合成代謝物的能力）基本培養(yǎng)基細胞產(chǎn)量(gDW/L)蛇根堿(mg/L)蛇根堿含量（%DW）Blaydes7.64.40.06LS9.300MS8.910.40.12N-N2.32.00.09VM5.000White

0.800B5

5.100B5+2,4-D1mg/L14.60.50.01B5+2,4D2mg/L5.200B5+NAA1.86mg/L7.61.20.02Heller+IAA0.175+BA1.13mg/L5.46.60.12（2）優(yōu)化培養(yǎng)基（次生代謝物的產(chǎn)量=細胞生長量×細胞合成代40——基本培養(yǎng)基：不同的基本培養(yǎng)基對細胞生長和次生代謝物的合成影響很大。基本培養(yǎng)基中N和P的濃度高往往有利于生長，但不利于次生代謝物的合成。——植物激素：植物激素對次生代謝物生產(chǎn)的影響非常復(fù)雜。一般2,4-D促進細胞生長，但抑制代謝物的合成。如在有2,4-D存在時，長春花、蔓陀蘿、天仙子、罌粟等細胞不能合成生物堿，雞眼藤不能合成蒽醌。紫草細胞培養(yǎng)時，IAA能促進紫草素的合成，而NAA，2,4-D則抑制其形成。但高濃度的2,4-D卻能促進煙草中泛醌-10的合成。

——基本培養(yǎng)基：不同的基本培養(yǎng)基對細胞生長和次生代謝物的合成41

（3）

飼喂前體物質(zhì)（precursor）藥物有效成分生物合成途徑中的中間物質(zhì)。添加前體物質(zhì)是提高次生代謝物產(chǎn)量的一個有效方法。如紫杉醇（Taxol）：

紫杉醇結(jié)構(gòu)可以分為母核（baccatinIII）和側(cè)鏈2部分,側(cè)鏈則是由苯丙氨酸與苯甲酸形成的；BaccatinIII是二萜類化合物，而二萜類化合物的生物合成途徑已經(jīng)基本明確。（3）飼喂前體物質(zhì)（precursor）藥物有效成分生物42紫杉二烯單萜化合物C10倍半萜化合物C15其它二萜化合物異戊二烯乙酰輔酶A牻牛兒醇法呢兒醇牻牛兒醇基牻牛兒醇紫杉二烯單萜化合物C10倍半萜化合物C15其它二萜化合物異戊43試驗證明，向培養(yǎng)基中添加紫杉醇合成的前提物質(zhì)（牻牛兒醇、牻牛兒醇基牻牛兒醇苯甲酸、苯丙氨酸等）可以使紅豆杉細胞中紫杉醇含量提高3-5倍；

向鬼臼細胞培養(yǎng)基中添加前提物質(zhì)使鬼臼毒素含量提高12倍。

試驗證明，向培養(yǎng)基中添加紫杉醇合成的前提物質(zhì)（牻牛44（4）使用誘導(dǎo)子（elicitor）誘導(dǎo)子是指能刺激細胞合成次生代謝產(chǎn)物的物質(zhì)。誘導(dǎo)子分為生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子。生物誘導(dǎo)子是指微生物，特別是致病微生物（活菌、高溫滅菌后的菌物或其勻漿物）、微生物多糖等；非生物誘導(dǎo)子是指重金屬離子（Ag+,V2+,Hg2+,Cu2+）或Ca2+等。誘導(dǎo)子一般是在細胞培養(yǎng)的中后期（接近細胞最大生長期）加入。

（4）使用誘導(dǎo)子（elicitor）誘導(dǎo)子是指能刺激細胞合45植物生物技術(shù)在生物制藥中的作用課件46化合物植物細胞誘導(dǎo)前產(chǎn)量誘導(dǎo)后產(chǎn)量生物堿罌粟2.9mg/L78mg/L黃酮蕓香0.01mg/L0.5mg/L棉酚棉花2.0mg/L200mg/L皂素薯蕷130mg/L230mg/L紫杉醇紅豆杉2.5mg/L5.5mg/L化合物植物細胞誘導(dǎo)前產(chǎn)量誘導(dǎo)后產(chǎn)量生物堿罌粟2.9mg/L47（5）改善培養(yǎng)條件光照：光照可以刺激長春花細胞合成蛇根堿、銀杏細胞合成黃酮，卻抑制黃連細胞中小檗堿、紅豆杉細胞中紫杉醇的合成溫度：長春花和駱駝蓬細胞的最佳生長溫度分別是27℃和30℃，但合成生物堿的最佳溫度是分別是16℃和25℃。但胡蘿卜在25℃和28℃時細胞合成花色素的能力無差異。PH值：雷公藤細胞合成雷公藤素乙的能力在pH6.0時最強；番薯細胞合成色醇的能力在pH6.3時最大，在pH4.8時則不能合成；胡蘿卜細胞合成花色素的能力在pH4.5時最強，提高pH值則導(dǎo)致合成能力下降。

（5）改善培養(yǎng)條件光照：光照可以刺激長春花細胞合成蛇根堿、48（6）改進培養(yǎng)方法——兩步培養(yǎng)法：細胞生長與有效成分合成所需要的條件往往不同、不同步，有效成分的合成與積累落后于生長。在前期促進細胞生長，在后期促進合成，從而兼顧細胞的生長量和次生代謝物的合成，達到提次生代謝物產(chǎn)量的目的。（6）改進培養(yǎng)方法——兩步培養(yǎng)法：49云南紅豆杉細胞生長與紫杉醇含量動態(tài)紫杉醇含量生長量云南紅豆杉細胞生長與紫杉醇含量動態(tài)紫杉醇含量生長量50植物生物技術(shù)在生物制藥中的作用課件51——兩相培養(yǎng)法：根據(jù)化學(xué)反應(yīng)平衡原理知道，產(chǎn)物的積累會抑制化學(xué)反應(yīng)正方向的速度（反饋調(diào)節(jié)），還可能會對細胞生長有毒害；移去產(chǎn)物則可以促進化學(xué)反應(yīng)朝正方向進行。因此，如果將產(chǎn)物富集起來、與細胞體系相對隔離，就有利于產(chǎn)物的合成。兩相培養(yǎng)可以解決這個問題。——兩相培養(yǎng)法：52兩相培養(yǎng)法有2種方式。液—固培養(yǎng):液相是細胞和液體培養(yǎng)基，固相是能吸收藥物成分的物質(zhì)，如樹脂、活性炭等。液-液培養(yǎng):一層液相是細胞和液體培養(yǎng)基，另一層液相是能溶解次生代謝物的有機溶劑（如乙酸乙酯）。這2種方法都可以減少培養(yǎng)基中有效成分濃度，防止負反饋調(diào)節(jié)，從而提高代謝物的產(chǎn)量。香竺葵細胞兩相培養(yǎng)（液-液培養(yǎng)）：倍半萜的產(chǎn)量提高了500倍。

兩相培養(yǎng)法有2種方式。53土壤農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）是一種革蘭氏陰性土壤桿菌，在自然界中普遍存在，其特點是能感染雙子葉植物，并引起植物形成腫瘤。三、植物基因工程與生物制藥植物基因工程：

把外源基因?qū)胫参锛毎@得能表達