關于細胞培養及動力學第1頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五Operationofbioreactor反應器操作1.Batchoperation間歇反應

Periodsofoperationforbatchoperation第2頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五1.Batchoperation第3頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五2.Semi-continuousorfed-batchoperation半連續操作3.Continuousoperation連續操作第4頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五本章主要分析討論間歇培養和連續培養這兩種基本方法，然后對其它培養方法進行擴展討論。第5頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五7.1微生物反應過程的計量學化學計量學：是對化學反應的組成和化學反應轉化程度的數量化研究。A+BC+D元素平衡法

化學計量學反應工程學反應熱力學反應動力學根據化學計量學，可知有關反應過程中各種反應組分的數量關系。研究化學計量學的目的是對反應過程進行控制和優化，爭取獲得最大的經濟收益。

第6頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五微生物反應過程的計量學：碳源（多種）+氮源（多種）+無機鹽（多種）+有機生長因子（多種）+水+氧氣細胞+主產物+副產物（多種）+二氧化碳對于微生物反應過程，由于參加反應的組分多，代謝途徑錯綜復雜，同時微生物在生長，并且微生物菌體也不能用摩爾—摩爾的對應關系表示其計量關系。所以要用元素平衡的方法對微生物反應進行計量，將是十分復雜和困難的。第7頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五工程上又不能回避這個問題，每一個工業化的微生物反應過程都需要計量。人們提出了一個相對簡單的方法，就是引入得率系數（Yieldcoefficients）的概念，作為描述微生物反應中計量關系的宏觀參數。得率系數有以下幾種定義：1、對基質的細胞得率Yx/s(Monod提出的)Yx/s==生成細胞的質量消耗基質的質量△x-△s

第8頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五在分批培養時，培養基的組分在不斷地變化，因此在培養過程中細胞得率系數不能視為常數，在某一瞬時的細胞得率稱為微分細胞得率（或者稱為瞬時細胞得率）。分批培養過程，總的細胞得率為：

Yx/s＝x0、s0：反應開始時細胞和基質濃度xt、st：反應結束時細胞和基質濃度xt-x0s0-st第9頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五2、對碳的細胞得率Yc考慮碳源基質時，無論是需氧還是厭氧培養，宏觀上碳源的一部分被同化為細胞組成物質，其余部分分別被異化、分解為二氧化碳及其它代謝產物。為了表示由碳源同化為細胞組成物質過程的轉化效益，采用對碳的細胞得率YcYc=

Yc<1

一般在0.4~0.9左右的范圍內。生成細胞量×細胞含碳量基質消耗量×基質含碳量第10頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五3、對ATP生成的細胞得率YATP微生物通過基質的氧化而獲得細胞合成、物質代謝、物質傳遞過程等生命活動所必需的能量。但是它并不是利用了基質氧化的全部能量，而只有在氧化反應中以生成ATP形式獲得自由能，被微生物生命活動所利用，其余部分作為反應熱釋放到環境中。據此，ATP的生成量和細胞生長量有關聯，以異化代謝過程中ATP的生成量作為細胞得率的基準。YATP表示為：YATP＝碳源對菌體的得率消耗1mol碳源由分解代謝產生ATP的摩爾數第11頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五根據大量實驗發現，在厭氧培養時，YATP值與微生物、基質的種類無關，基本上為常數，YATP=10YieldcoefficientsBiomass/substrate:Yx/s=-△x/△sProduct/substrate:Yp/s=-△p/△sProduct/biomass:Yp/x=-△p/△x第12頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五7.2微生物反應動力學的描述方法

細胞生長動力學微生物反應動力學反應基質消耗動力學代謝產物生成動力學1、模型的簡化細胞的生長、繁殖代謝是一個復雜的生物化學過程。該過程既包括細胞內的生化反應，也包括胞內與胞外的物質交換，還包括胞外的物質傳遞及反應。該體系具有多相、多組分、非線性的特點。第13頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五第14頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五多相指的是體系內常含有氣相、液相和固相；多組分是指在培養液中有多種營養成分，有多種代謝產物產生，在細胞內也具有不同生理功能的大、中、小分子化合物；非線性指的是細胞的代謝通常需用非線性方程來描述。FreshMediaFeedDissolveO2SensorThermocoupleInletAirFlowExitGasFlowAcid/baseAntifoampHSensorLevelSensorAgitatorSparserExitLiquidFlow第15頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五同時，細胞的培養和代謝還是一個復雜的群體的生命活動，通常每1ml培養液中含有104~108個細胞，每個細胞都經歷著生長、成熟直至衰老的過程，同時還伴有退化、變異。因此，要對這樣一個復雜的體系進行精確的描述幾乎是不可能的。為了工程上的應用，首先要進行合理的簡化，在簡化的基礎上建立過程的模型。第16頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五要簡化的內容有以下幾點：①微生物反應動力學是對細胞群體的動力學行為進行描述。②不考慮細胞之間的差別(Treatedallcellsasequivalent)，而是取其性質上的平均值。（在此基礎上建立的模型稱為非確定論模型Unsegregated）。③在細胞的生長過程中，細胞內各種成分視為以相同的比例增加，而且忽略環境的變化對菌體組成的影響。第17頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五兩個概念：均衡生長和非結構模型。在細胞的生長過程中，如果細胞內各種成分均以相同的比例增加，則稱為均衡生長；那么非均衡生長呢？細胞生長時胞內各組分增加的比例不同，稱為非均衡生長。結構模型：細胞的組分是復雜的，有蛋白質、脂肪、碳水化合物、核酸、維生素等，這些成分的含量大小隨環境條件的變化而變化。如果是在考慮細胞組成變化的基礎上建立的模型，則稱為結構模型，它能從機理描述細胞的動態行為。在結構模型中，一般選取RNA、DNA、糖類及蛋白質的含量作為過程的變量，將其表示為細胞組成的函數。第18頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五但是，由于微生物反應過程極其復雜，加上檢測手段的限制，缺乏可直接在線測量的傳感器，給動力學研究帶來了困難，致使結構模型的應用受到了限制。如果把菌體視為單組分，則環境的變化對菌體組成的影響可被忽略，在此基礎上建立的模型稱為非結構模型。它是在實驗研究的基礎上，通過物料衡算建立起經驗或者半經驗的關聯式。Structured-“detailed”intracellulardescriptionUnstructured-“simple”intracellulardescription從模型的簡化考慮一般采用：均衡生長的非結構模型第19頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五2、反應速率的定義

常采用兩種速率概念：絕對速率和比速率①絕對速率（又簡稱為速率）細胞生長率rx=基質消耗速率：

rs=產物生成速率：

rp=dxdt-dsdtdtdp這些速率的單位：g/L·h第20頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五②比速率

Specificgrowthrate比生長速率μ=[h-1]基質消耗比速率：[h-1]產物生成比速率：[h-1]比速率和細胞量有關，比速率的大小反應了細胞活力的大小。dxdt1dxdtx1dxdtx1dsdtx1dsdt第21頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五Section2.Batchcultureandkinetics分批培養：是指在滅菌后的培養基中，接種微生物（某種），開始在一定的條件下培養微生物，在培養過程中不再向培養基中加入或移去主輔物料（如果是需氧微生物，則需不斷通風供氧）的培養方式。第22頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五分批培養的最大特點是：反應體系的微生物濃度和生理狀態隨培養時間變化，反應體系中的營養成分和代謝產物亦隨培養時間變化。第23頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五2.1MicrobialgrowthkineticsMicrobialgrowthkineticsdescribedhowthemicrobegrowthinthefermenter.Thisinformationisimportanttodetermineoptimalbatchtime.第24頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五MicrobialgrowthkineticsThegrowthofmicrobesinafermentercanbedisassembledintofourstages:-Lagphase-Logphase-Stationaryphase-Deathphase第25頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五第26頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五MicrobialgrowthkineticsLagphase-Thisisthefirstphaseinthefermentationprocess.-Thecellshavejustbeeninjectedintoanewenvironmentandtheyneedsometimetoadjustaccordingly.-Cellgrowthisminimalinthisphase.第27頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五MicrobialgrowthkineticsLogphase-Thesecondphaseinthefermentationprocess.-Thecellshaveadjustedtotheirenvironmentandarapidgrowthtakeplace.-Cellgrowthrateisthehighestinthisphase.第28頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五MicrobialgrowthkineticsLogphase-Atsomepoint,thecellgrowthratewillleveloffandbecomeconstant.-Themostlikelycauseofthisleveloffissubstratelimitedinhibition.-Substratelimitedinhibitionmeansthatthemicrobesdonothaveenoughnutrientsinthemediumtocontinuemultiplying.第29頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五MicrobialgrowthkineticsStationaryphase-Thisisthethirdphaseinthefermentationprocess.-Thecellgrowthratehasleveledoffandbecomeconstant.-Thenumberofcellsmultiplyingequalstothenumberofcellsdying.第30頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五MicrobialgrowthkineticsDeathphase-Thefourthphaseinthefermentationprocess.-Thenumberofcellsdyingisgreaterthanthenumberofcellsmultiplying.Thecauseofthedeathphaseisusuallythatthecellshaveconsumedmostofthenutrientsinthemedium,andthereisnotenoughnutrientsleftforsustainability.第31頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五Mediaforindustrialfermentation

Themediaisthefeedsolution-Itmustcontaintheessentialnutrientsneededforthemicrobetogrow.Factorsneedforconsiderationwhenchoosingmedia:-Qualityuniformityandavailability.-Ensuretherearenoproblemswithmediaprepareorotheraspectsofproductionprocess.

Ex.Canemolasses,beetmolasses,cerealgrains.第32頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五Thedevelopmentofinoculaforindustrialfermentation

Theinoculumisthestarterculturethatisinjectedintothefermenter.-Itmustbeofsufficientsizeforoptimalgrowthkinetics.Sincethefermenterforproductioninindustrialfermentationissolarge,theinoculumvolumhastobequitelarge.-Aseedfermenterisuauallyrequiredtoproducetheinoculum.-Theseedfermenter’spurposeisnottoproduceproduct,buttoproduceinoculum.第33頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五Aboutlagphase在發酵工業生產中，為了提高生產效率，縮短生產的周期，希望延遲期縮短，要達到該目的，應一般遵循下列規則：

(1)接種的微生物應盡可能是高活力的（要用處于指數期的微生物作種子）。(2)用于培養種子的介質和條件應盡可能接近生產上使用的發酵液組成和培養條件。(3)采用大接種量。因細胞內部的某些維生素和輔酶等生長素，向周圍培養液發生過多的擴散，從而降低細胞的活性，延長延遲期。第34頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五Aboutlogphase對數生長期的微生物生長速率正比于原有的微生物數，因此可以直接得出微生物的基本生長動力學方程：

=μxμ=因為微生物以自我復制的方式增殖，所以微生物生長速率與現存的細胞量或菌體濃度x成正比，那么以對數生長方式生長也是必要的。dxdtx1dxdt第35頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五=

μxμ=μ為比生長速率為生長速率x為菌體濃度，t

為培養時間雖然以上方程由對數生長期得出，但對其它生長期也同樣適用。μ在對數期是常數，取得最大值，在其他生長期不是常數。分析各生長不同時期的μ數值。dxdtx1dxdtdxdt第36頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五Lagphase

x無凈生長

μ=0

加速生長期x增加

μ2>μ1Logphasex對數增加μ=常數減速生長期x增加緩慢

μ4<μ3Stationaryphase

x無凈生長μ=0

Deathphase

x減少μ<0第37頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五2.2微生物生長速率與底物濃度的關系

微生物的生長速率受到許多因素的影響，T、pH、底物濃度都影響微生物的生長速率。這里需要提出來討論的是底物濃度與微生物生長速率之間的關系。在一定條件下，微生物的生長速率是底物濃度s的函數

＝f(s)這是怎樣的函數關系呢？dxdt第38頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五1949年Monod發現，細菌的比生長速率與單一限制性底物之間存在這樣的關系：

μ=

μmμ:比生長速率(h-1)μm:最大比生長速率(h-1)KS:微生物生長的飽和常數(g/L)S:限制性底物濃度SKS+S第39頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五S=ConcentrationofratelimitingsubstrateKS=Saturationconstantμm=Maximumspecificgrowthrate(S>>KS)第40頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五Monod模型是典型的均衡生長模型，其基本假設如下：（1）描述細胞生長的唯一變量是細胞濃度X；（2）培養基中只有一種基質是生長限制性基質，其他組分均過量；（3）細胞的生長視為單一反應，細胞得率為常數，當S<<KS時，μ=

μmS/KS，μ與

S是一級動力學關系；S>>KS時，μ=

μm，μ與

S是零級動力學關系；第41頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五什么是限制性底物(Limitedsubstrate)？可以是培養基中任何一種與微生物生長有關的營養物，只要該營養物相對貧乏時，就可能成為限制微生物生長的因子，可以是C源、N源、無機或有機因子。

那么營養物質相對貧乏指的是多少量呢？第42頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五是指該物質的濃度低于比生長速率μ達μm時對應的最低底物濃度Scrit時的情形。Scrit稱為臨界底物濃度，任一營養物質的濃度若高于Scrit則為非限制性底物，低于Scrit即為限制性底物。μSScrit第43頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五所以限制性底物就是在培養微生物的營養物質中，對微生物的生長起到限制作用的營養物。

μ=

μm莫諾方程表面上與米氏方程同型。但是Monod方程來自于對實驗現象的總結，而米氏方程是根據酶促反應機理推導出的。前者是經驗方程，后者是機理方程。SKS+S第44頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五莫諾方程中的動力學常數μm和KS可以用倒數作圖法得出。

Hanes作圖用前一方程圖解時，可得到相當精確的μm值，但在低S值時，的偏差較大，影響KS值的精度。第二方程好用一些，在低S值時精度高。也可用線性回歸方法。1μ=1μm+KSμm·1SSμ=1μm+KSμm·S第45頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五一些典型的μm和KS值

第46頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五可見，典型的ks值很小，實驗時用的底物濃度很小，這樣低的s值，又要快速測出它的變化量，那就要采用極為靈敏的、準確的測定底物和菌體濃度的方法，才能通過測定間歇培養的初速度反應來測定ks值。第47頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五Monod方程適用于許多微生物生長過程，但是因該方程表述簡單，不足以完整地說明復雜的生化反應過程，已發現它在某些情況下與實驗結果不符，因此人們又提出了另外一些方程來描述微生物的生長。如Powell提出的：

μ=

μm考慮到細胞壁的滲透性和基質的擴散性，引入KD因子，稱為擴散阻力常數。S（KS+KD）

+S第48頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五2.3有抑制的細胞生長動力學

（1）Substrateinhibitionkinetics與酶促反應類似，有時當培養基中某種基質的濃度高到一定程度時后，細胞的比生長速率隨該基質濃度的升高而下降，表現出基質的抑制，提出了一些描述基質抑制的生長動力學模型。

μ(S)=KⅠ=inhibitionconstantμm

SKS+S

+S2/KⅠ第49頁，共58頁，2022年，5月20日，19點4分，星期五（1）SubstrateinhibitionkineticsμμmKSKIS

當S=

細胞的生長速率達最大，其值為：√KSK