內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座11/12/2022綿羊肺腺瘤病綿羊肺腺瘤病的病原是綿羊肺腺瘤病毒（jaagsiektesheepretrovirus，JSRV），其主要臨床癥狀為咳嗽、呼吸困難、虛弱、漸進(jìn)性消瘦、大量漿液性鼻漏；主要病變?yōu)榉闻茛蛐蜕掀ぜ?xì)胞（typeⅡpneumocytes）和無纖毛細(xì)支氣管上皮細(xì)胞（claracells）腺泡樣腫瘤性增生。11/12/2022綿羊肺腺瘤病毒綿羊肺腺瘤反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組RNA為線性單股正鏈RNA，全長7642bp。11/12/2022該病毒基因組RNA的編碼區(qū)內(nèi)有相互重疊的gag、pro、pol和env基因的典型結(jié)構(gòu)。gag基因編碼病毒的衣殼蛋白（capsidprotein，CA）、核衣殼蛋白（nucleocapsidprotein，NC）和基質(zhì)蛋白（matrixprotein，MA），而gag基因編碼區(qū)的第513～1400bp段主要編碼衣殼蛋白，衣殼蛋白構(gòu)成病毒粒子雙層殼的內(nèi)殼，與病毒的抗原性有關(guān)。11/12/2022JSRV的pro基因所編碼的蛋白以聚合多肽蛋白前體Gag-pro形式表達(dá)。pro基因的5’端和3’端分別編碼dUTP酶和羧基蛋白酶PR，dUTP酶可以防止反轉(zhuǎn)錄酶誤裝配三磷酸脫氧尿苷，而PR負(fù)責(zé)裂解前體多肽蛋白。二者在病毒粒子的反轉(zhuǎn)錄、成熟與包裝等病毒生活周期中起關(guān)鍵作用。11/12/2022pol基因主要編碼病毒的反轉(zhuǎn)錄酶（reverse

transcriptase，RT）和整合酶（integrase，IN），RT負(fù)責(zé)把病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為病毒cDNA，IN負(fù)責(zé)將前病毒DNA基因組整合至宿主細(xì)胞的染色體DNA中。env基因主要編碼病毒的囊膜蛋白，蛋白質(zhì)部分由二條肽鏈組成，較小的一條鏈貫穿病毒的囊膜，稱為跨膜蛋白（transmembraneprotein，TM），較大的鏈通過二硫鍵和氫鍵與TM相連，稱為表面蛋白（surfaceprotein，SU）。11/12/2022EndogenousRetrovirusesinTrophoblastDifferentiationandPlacentalDevelopment在滋養(yǎng)層分化和胎盤發(fā)育過程中的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒SarahG.Black1,FredrickArnaud2,3,MassimoPalmarini2,ThomasE.Spencer1

得克薩斯大學(xué)

一、前言二、方法三、結(jié)果四、結(jié)論11/12/2022一、前言(Introduction)內(nèi)源性病毒是指病毒在初次感染機(jī)體或細(xì)胞后，其基因組被整合到宿主細(xì)胞的DNA中，并成為宿主細(xì)胞基因組的一部分，即以前病毒的形式存在，前病毒DNA可通過細(xì)胞分裂傳遞給子代細(xì)胞。11/12/2022內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（ERV）ERVs存在于所有脊椎動物的基因組中并遵照孟德爾法則遺傳給下一代。ERVs在宿主基因組中大量存在，例如人的基因組中大約有8~10%ERVs。一個完整的ERVs前病毒和外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒有同樣的基因結(jié)構(gòu)。如果ERVs表達(dá)產(chǎn)物對宿主有害的話，宿主將會消滅它們。ERVs存在于宿主基因組中，是長期進(jìn)化的結(jié)果。通常由于突變、缺失、重排和甲基化的積累給予了ERVs不健全的復(fù)制機(jī)制。11/12/2022現(xiàn)代內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒現(xiàn)代內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒是指在物種形成后才整合到宿主基因組中的，而且非常接近具有傳染性的外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒。這些現(xiàn)代內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒包括綿羊肺腺瘤病毒、小鼠乳腺癌病毒、貓白血病病毒、雞白血病病毒。許多現(xiàn)代內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠產(chǎn)生感染性病毒粒子，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈︹g化突變。11/12/2022ERVs在過去被認(rèn)為是垃圾DNA，但最近研究表明ERVs對其宿主有重要的生物學(xué)作用。因?yàn)橥暾拈_放閱讀框和轉(zhuǎn)錄活性支持了之一觀點(diǎn)。ERVs大量存在于多種動物的生殖道和胎盤內(nèi)。完整的ERVs的env基因在胎盤的巨核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)且維持了數(shù)千年。此基因的表達(dá)產(chǎn)物可引起體外培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生融合。11/12/2022二、ERVsinthehuman,mouse,andrabbitplacenta在人類、小鼠、兔子和綿羊的胎盤內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄病毒人類小鼠兔子綿羊11/12/20222.1人類HERV-W、HERV-FRD和ERV-3是3個人類的內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒。他們完整的env基因在人類胎盤中表達(dá)。11/12/20222.1.1HERV-WHERV-W不以完整的前病毒存在與人類的基因組當(dāng)中，然而他的env基因編碼的蛋白叫做syncytin1,在核胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)。syncytin1是一種糖蛋白且具有反轉(zhuǎn)錄病毒囊膜蛋白的特點(diǎn)，例如：前導(dǎo)肽、弗林蛋白酶切割位點(diǎn)、融合肽樣序列、公認(rèn)的免疫抑制區(qū)和跨膜區(qū)。這些大量的體外信息都暗示了，syncytin1與人類胎盤當(dāng)中的單核滋養(yǎng)層細(xì)胞融合成雙核滋養(yǎng)呈細(xì)胞有關(guān)。11/12/2022有人通過轉(zhuǎn)染HERV-W-env誘導(dǎo)了許多細(xì)胞系發(fā)生融合，當(dāng)用抗HERV-W-env的抗體處理細(xì)胞后細(xì)胞融合的數(shù)量減少了。通過高表達(dá)syncytin1和forskolin共同誘導(dǎo)BeWo細(xì)胞融合，當(dāng)抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞中syncytin1的表達(dá)時，培養(yǎng)的雙核滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)量減少。11/12/20222.1.2HERV-FRDHERV-FRD囊膜蛋白被稱為syncytin2，它的結(jié)構(gòu)與syncytin1類似。然而syncytin2要比syncytin1整合到人類基因組上要早得多。當(dāng)瞬時轉(zhuǎn)染syncytin2時也能引起細(xì)胞融合。11/12/20222.1.3ERV-3ERV-3的囊膜蛋白也出現(xiàn)在滋養(yǎng)層當(dāng)中，但在他的開放閱讀框中提前出現(xiàn)了終止密碼子，導(dǎo)致他失去了跨膜區(qū)等多個功能區(qū)。ERV-3囊膜蛋白不能引起細(xì)胞的融合即使在BeWo細(xì)胞當(dāng)中高表達(dá)ERV-3囊膜基因且同時用forskolin處理，也不能引起細(xì)胞融合。11/12/2022ERV-3在滋養(yǎng)層細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，它可誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞分化、人絨毛膜促性腺激素分泌量增加、形態(tài)改變。研究認(rèn)為ERV-3-env在許多正常組織中表達(dá)，尤其在產(chǎn)生激素的器官中包括腎上腺、皮脂腺和睪丸當(dāng)中表達(dá)。他可能在激素分泌的過程中扮演了重要角色。但150個健康的白種人當(dāng)中有1.5個人的ERV-3-env基因提前終止（理論上沒有功能）。所以人們爭論ERV-3是否具有生物學(xué)功能。11/12/202211/12/20222.2小鼠在小鼠胎盤迷路滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)的兩種內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的囊膜蛋白syncytinA和syncytinB。syncytinA和syncytinB是同源基因且高度保守。syncytinA在小鼠滋養(yǎng)層的發(fā)育扮演了重要的角色，因?yàn)槿笔yncytinA的小鼠胎盤里單核細(xì)胞不能融合形成多核細(xì)胞而發(fā)生流產(chǎn)。11/12/2022２．３兔子最近，Heidmannetetal.發(fā)現(xiàn)兔子反轉(zhuǎn)錄病毒囊膜基因且命名為syncytin－OryⅠ，他與人類的syncytin特征相似。通過生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在兔子胎盤中特定表達(dá)的syncytin－OryⅠ在兔子基因組當(dāng)中具有完整的開放閱讀框。syncytin－OryⅠｍＲＮＡ被發(fā)現(xiàn)在兔子胎盤連接處即胎兒組織侵入母體子宮兌膜后形成的迷路滋養(yǎng)層中高表達(dá)。這與syncytin在滋養(yǎng)層形成過程中有重要作用觀點(diǎn)一致！11/12/2022２．４綿羊綿羊基因組當(dāng)中至少有２７個拷貝的ERVs，因?yàn)樗鼈兣c外源性綿羊肺腺瘤（JSRV）非常相似，故命名為enJSRVs。JSRV是綿羊肺腺瘤的病原，具有傳染性。JSRV不同于其他致癌反轉(zhuǎn)錄病毒是因?yàn)樗闹掳┗蚴悄夷さ鞍住１M管JSRV囊膜蛋白引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中與促細(xì)胞分裂蛋白激酶（Ras-MEK-MAPK）、RacⅠ和磷酸次黃苷酸３激酶（PI3K-AKT-MTOR）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，但具體機(jī)制還沒有完全弄清楚。11/12/2022２７個enJSRV前病毒中有大部分由于缺失突變導(dǎo)致不完整。然而有５個enJSRV前病毒具有完整的開放閱讀框。JSRV和enJSRV相似性非常高，所以enJSRV侵入綿羊基因組當(dāng)中時間不長，甚至現(xiàn)在還一直在侵入。蒙古綿羊在不同妊娠時期（30d、50d、70d、90d、110d和130d）子宮和胚胎組織中均有enJSRVmRNA表達(dá)。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出：胎盤組織中enJSRV基因的表達(dá)于90d時達(dá)到高峰，然后開始下降，直至妊娠130d時表達(dá)量達(dá)到最低；子宮內(nèi)膜組織中enJSRVmRNA的表達(dá)于30d和50d相對較高；絨毛膜組織中enJSRVmRNA的表達(dá)于妊娠50d時表達(dá)量最低，70d和110d相對較高。（徐萌杰博士論文）11/12/2022３、綿羊的胎盤和孕體的發(fā)育過程受精卵的發(fā)育與運(yùn)行

由于輸卵管管壁肌肉的蠕動及輸卵管粘膜纖毛的擺動，受精卵漸漸向子宮腔方向移動，在受精后3～4天到達(dá)宮腔，在運(yùn)行過程中進(jìn)行有絲分裂，受精卵到達(dá)輸卵管子宮端時已成為一個實(shí)心細(xì)胞團(tuán)，形如桑椹，故稱桑椹胚。桑椹胚一面前行，一面繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞分裂，外層細(xì)胞分裂較快，形成囊壁，稱為滋養(yǎng)層，是受精卵接觸母體的部分，它將形成胎盤及其它胚外結(jié)構(gòu)。內(nèi)層細(xì)胞分裂較慢，形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，是胚胎發(fā)育的始基。此時的受精卵稱為囊胚或胚泡。約在受精后7～8天，滋養(yǎng)層細(xì)胞與子宮內(nèi)膜接觸時分化出合體細(xì)胞。子宮內(nèi)膜被合體細(xì)胞的蛋白分解酶破壞，囊胚即侵入子宮內(nèi)膜的致密層，子宮內(nèi)膜表面迅速修復(fù)，囊胚即埋于子宮內(nèi)膜中。11/12/202211/12/2022約在受精后9～10天，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)很快增殖與分化，分裂成兩層，即外胚層與內(nèi)胚層。兩層細(xì)胞分裂都很快，并各形成一空腔，即羊膜腔與卵黃囊，二者之間的組織稱為胚盤。第12天使形成卵圓形的孕體，且之后開始慢慢變長。11/12/202211/12/2022在胚胎發(fā)育成桑椹胚后，桑椹胚進(jìn)一步發(fā)育，細(xì)胞開始出現(xiàn)分化。聚集在胚胎的一端，個體較大的細(xì)胞，稱為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（innercellmass，ICM），將來發(fā)育成胎兒的各種組織，而沿透明帶內(nèi)壁擴(kuò)展和排列的，個體較小的細(xì)胞，稱為滋養(yǎng)層細(xì)胞，它們將來發(fā)育成胎膜和胎盤。絨毛膜的滋養(yǎng)細(xì)胞在妊娠中期可分成兩種類型：合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞有絲分裂活躍，形成新的滋養(yǎng)細(xì)胞，新滋養(yǎng)細(xì)胞膜消失，融合形成合體滋養(yǎng)細(xì)胞。合體滋養(yǎng)細(xì)胞是人體正常細(xì)胞中唯一具有侵襲能力的細(xì)胞，類似于腫瘤細(xì)胞，具有一定的侵襲能力，這種能力對胚泡著床及胎盤的形成均有十分重要的意義。11/12/2022BNC的形成綿羊單核滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞（mononucleartrophoblasticcell，MTC）從妊娠第14天開始分化、移行，之后通過核內(nèi)復(fù)制或融合作用形成滋養(yǎng)外胚層巨型雙核細(xì)胞（trophoblasticgiantbinucleatedcell，BNC），BNC繼而移行并與子宮內(nèi)膜的腔上皮細(xì)胞（luminalepithelium，LE）融合為三核細(xì)胞，三核細(xì)胞與BNC融合，形成多核合胞體，多核合胞體融聚成多核合胞體小半鞘翅（multinucleatedsyncytiaplaques）（20～25個核），最終形成胎盤的子葉。11/12/2022在母羊的生殖道不同組織上皮中大量表達(dá)enJSRV。尤其在子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮當(dāng)中可檢測到enJSRV的mRNA和蛋白。有趣的是，HYAL2(是JSRV和enJSRV的受體)被專一的檢測到在胎盤的BNC和小半鞘翅中表達(dá)。有研究者通過在妊娠8天的母羊子宮內(nèi)注射嗎啉代，抑制enJSRV囊膜蛋白的翻譯。結(jié)果單核滋養(yǎng)層細(xì)胞的數(shù)量減少且BNC的分化也減弱了。這讓許多科學(xué)家提出了綿羊多核合胞體形成假說。11/12/20