ICS 65.020B01

DB37山 東 省 地 方 標 準DB37/T3894—2020術規(guī)程DetectionandidentificationofturnipmosaicvirusandcucumbermosaicvirusinDetectionandidentificationofturnipmosaicvirusandcucumbermosaicvirusinChinesecabbage2020033120200501山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本標準按GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由山東省農業(yè)農村廳提出并組織實施。本標準由山東省農業(yè)標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：山東省農業(yè)科學院植物保護研究所。本標準主要起草人：吳斌、辛相啟、王升吉、姜珊珊、張眉、辛志梅。大白菜蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒檢測技術規(guī)程范圍ELISADot-ELISART-PCR本標準適用于山東省蕪菁花葉病毒、黃瓜花葉病毒在傳播介體蚜蟲和大白菜中的檢測。GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法用直徑33cm的35目紗網在田間隨機進行掃撲，分揀裝入試劑瓶中，100%乙醇浸泡，-20℃以下冰箱保存?zhèn)溆谩?.2葉片樣品采集TuMVCMV2°C～8°C-80℃4主要儀器設備、用具和試劑儀器設備主要有：0.001g）；PCRj)樣品冷藏柜；k)低溫冰箱（-20°C）；（-80°C）；（10μL100μL200μL、1000μL）用具用具主要有：RNase（10μL、100μL、200μL1000μL）；（NCRNasePCRTuMVCMVTuMVCMVTrizolM-MLVRTRNATaqDNADNAGelred試驗用水為無菌超純水或去離子水，均符合GB/T6682-2008。血清學和分子生物學檢測試劑配制見附錄A。檢測RNAELISA、Dot-ELISA和RT-PCR300μL4h～5h8000r/min3minCMVRT-PCR加樣100μL，4°C12h～16h洗板孵育結束后，用PBST清洗酶標板3次～5次。每孔每次加PBST洗液700μL，每次停留1min～2min。用抗體稀釋緩沖液按照相應病毒抗血清的使用濃度進行稀釋，每孔加入稀釋好的抗體液100μL，加蓋，37°C孵育1.5h。洗板同5.2.3。1.5h洗板同5.2.3。將現配的底物緩沖液按100μL/孔，加入到酶聯(lián)板中，室溫避光孵育1h。讀數100μL3mol/LNaOH405nm（OD405）NC剪裁7cm×7cm大小的NC膜，用鉛筆在保護紙外劃成7mm×7mm大小的方格，劃好后去掉保護紙備用。300μLPBS0.1g1：PBS8000r/minCMVRT-PCR加樣分別取2μL制備好的待檢測樣品、陰性對照、陽性對照、空白對照，點到NC膜的相應格子中，室溫干燥10min。每個樣品平行在膜上重復一次。封閉在平皿（F9cm）中加入20mL封閉液，并將干燥好的NC膜浸入，室溫下封閉30min。用封閉液按照相應病毒抗血清的工作濃度進行稀釋，并將NC膜浸入，室溫孵育30min～60min。洗膜將平皿中抗體液倒出，加入PBST20mL洗膜3次～4次，每次3min。用抗體稀釋緩沖液按說明將酶標抗體稀釋至工作濃度，并將NC膜浸入，室溫孵育30min～60min。洗膜同5.3.6。顯色顯色底物NBT66μL和BCIP33μL加到10mL底物緩沖液中混勻，洗好的膜用濾紙吸干后放入底物顯色液中反應，待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時終止反應（顯色5min～20min），即在蒸餾水中漂洗，肉眼觀察并記錄結果。RNA0.1gRNase1.5mL1mL的Trizol5min；4°C，12000g10min離心約離心1m74C700離心5i5mi～1mi，溶于30μLRNase的ddH2O-80°CTuMV或CMVRT-PCR委托引物合成公司進行引物合成，引物配制成10μmol/L儲存液備用，引物序列見表1。表1檢測引物序列檢測病毒引物名稱及序列擴增片段大小蕪菁花葉病毒TuMV-F:5′-GTAACCAAGACCGACCATAC-3′228bpTuMV-R:5′-TATGCCTCTCCGTGTTCT-3′黃瓜花葉病毒CMV-F:5′-AACCACCCAACCTTTGTAG-3′460bpCMV-R:5′-GCTCGACGTCAACATGAA-3′逆轉錄總體積為20μL。在無RNase的PCR管中依次加入3μL待檢測RNA，1μL相應病毒下游擴增引物無RNase的65°C5min5minPCRM-MLVRT（200U/μL）1μL、RNasin（40U/μL）1μL、5×RT4μL、dNTP（10mmol/L）2μLPCR儀中42°C反應1h，70°C反應5min。同樣處理陽性對照、陰性對照和空白對照，合成的cDNA置于-20°C以PCR依次在滅菌的PCR管中加入ddH2O14.8μL、10×PCR緩沖液2.5μL、MgCl2（25mmol/L）2.5μL、dNTP（10mmol/L）2μL、10pmol/μL上游引物1μL、10pmol/μL下游引物1μL、Taq酶（5U/μL）0.2μL、cDNA模板1μLPCR95°C5min，95°C30s，56°C30s，72°C1min，35制備1%的瓊脂糖凝膠。取上述PCR產物10μL，加入1μL上樣緩沖液，混勻后移入膠孔，并在樣品孔DNA30minOD405值）OD405值<0.15；OD405OD405>2；以上同時具備則本批次檢測有效，否則判定本批次檢測無效，需重新檢測。OD405值OD405值>2OD405值OD405值=2OD405值OD405<2肉眼觀察，陽性對照應出現棕紅色或深褐色圓形斑點，陰性對照應無顯色斑點。重復孔結果不一致時，視此次結果無效，需進行重新驗證。陽性。陽性對照、陰性對照和空白對照正確，且樣品無擴增條帶，判定結果為陰性。檢測結果表述如下：附錄A（規(guī)范性附錄）試劑配制（pH9.6）碳酸鈉（Na2CO3）1.59g，碳酸氫鈉（NaHCO3）2.93g，溶解于900mL蒸餾水中，用鹽酸調節(jié)pH至9.6，用蒸餾水定容至1000mL。PBST（pH7.4）氯化鈉（NaCl）8.0g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.15g，氯化鉀（KCl）0.2g，0.5mLTween-20，溶解于900mL蒸餾水中，用鹽酸調節(jié)pH至7.4，蒸餾水定容至1000mL。PVP（MW24～4000）（聚乙烯吡絡烷酮）2g，脫脂奶粉1g，溶解于100mLPBST中。（pH9.8）容至100mL。）1mgPNPP（對-硝基苯磷酸二鈉）溶于1mL底物緩沖液中。容至100mL。）1mgPNPP（對-硝基苯磷酸二鈉）溶于1mL底物緩沖液中?？寡鍓A性磷酸酶標記抗體。A.2斑點酶聯(lián)免疫吸附測定PBS（pH7.2）氯化鈉（NaCl）8.0g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.15g，氯化鉀（KCl）0.2g，溶解于900mL蒸餾水中，用鹽酸調節(jié)pH至7.2，蒸餾水定容至1000mL。PBST（pH7.4）氯化鈉（NaCl）8.0g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.15g，氯化鉀（KCl）0.2g，0.5mLTween-20，溶解于900mL蒸餾水中，用鹽酸調節(jié)pH至7.4，蒸餾水定容至1000mL。封閉液取脫脂奶粉5g加入到100mLPBST，充分溶解，4°C保存。（pH9.5）Tris·Cl12.11g，氯化鎂（MgCl2）2.38g，氯化鈉（NaCl）5.85g，溶解于900mL蒸餾水中，用氫氧化鈉調節(jié)pH至9.5，用蒸餾水定容至1000mL。）BCIP(50mg/mL)溶于100%二甲基甲酰胺；NBT(50mg/mLl)溶于70%二甲基甲酰胺。每5mL底物稀釋緩沖液中先加入33μL的NBT，混勻后再加入16.5μL的BCIP，該試劑配制好后，應在1h內使用?？寡?