抗腫瘤藥物的幾種初篩模型2003/6/27于志斌前言

近年來,國內外在海洋生物抗腫瘤活性物質篩選和研究上已取得了初步的成果。NCI每年篩選的出3萬個新的抗腫瘤化合物這些化合物絕大多數具有獨特的化學結構和明顯的抗癌、抗病毒作用,有以影響ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質為主的,也有以干擾有絲分裂或誘導細胞內信息分子的改變為主的。除了一些新的化合物，在一些老的化合物中也發現很多具有抗腫瘤的活性。活性化合物的篩選關鍵問題之一在于選擇有效的活性篩選模型。本文對ＭＴＴ法、ＤＤＲＴ法、稻瘟霉法以及鐮刀菌等幾種篩選模型進行簡單的介紹。MTT法ＭＴＴ法是一種檢測細胞生存和增殖狀態的方法,該方法以其簡單、快速、準確等優點被用于細胞毒和淋巴因子生長抑制的定量檢測,尤其在腫瘤化療藥敏實驗中廣泛使用。其原理是ＭＴＴ可被活細胞線粒體中的脫氫酶還原為藍色的甲基化合物,再經適當溶劑溶解后,其吸光度與活細胞數相關,從而可作為檢測活細胞數的指標。因此ＭＴＴ法可用于細胞毒活性物質的篩選。MTT法的基本步驟細胞培養至90%鋪底(處于對數生長期),用胰酶消化液消化收集細胞,吹打制成單細胞懸液,苔芬藍染色計算活細胞數,接種細胞于96孔板中,每孔加200μl懸浮細胞液,在37℃CO2培養箱培養過夜。第二天加入各稀釋度的菌株發酵液20μl,繼續培養3ｄ,倒去培養液,PBS洗1遍,加入ＭＴＴ(0.2ｍｇ/ｍl)100μl,在37℃培養4ｈ,然后去除ＭＴＴ,加ＤＭＳＯ與甘氨酸ＮａＯＨ緩沖液(9∶1)200μl,搖床搖0.5～1ｈ,酶標儀測定570nm吸光值。其中四孔做全培液空白對照,四孔做細胞懸浮液對照,每樣平行測試3孔,以阿霉素為標準參照.。計算抑制率：抑制率=100%×(ＯＤ對照-ＯＤ實驗)/ＯＤ對照發酵液活性以ID50衡量,ID50為抑制率為50%時,發酵液所稀釋的倍數；抗癌藥物的活性以IC50衡量,IC50為抑制率為50%時,樣品的濃度。DDRT法（differentDNArepairtest）試驗菌株343/591為賴氨酸和生物素營養缺陷型并具有發酵乳糖能力和DNA修復缺陷的菌種；343/636為不能發酵乳糖的脯氨酸營養缺陷型菌株并具有紫外線損傷和DNA修復能力。DDRT法是一種利用兩個菌株對DNA損傷修復的差異性建立的方法,可以用來檢測試驗物的DNA毒性。343/591為DNA修復缺陷菌株,而343/636菌株具有紫外線損傷和DNA修復能力,因而通過兩個菌株的修復能力不同可以檢測出受試物的DNA毒性。因而DDRT法可用于篩選得到作用于DNA的抗腫瘤活性菌株。稻瘟霉模型

近年來,人們發現大量的抗真菌和抗腫瘤化合物有明顯的致稻瘟霉菌絲彎曲作用或抑制發芽管生長作用,說明化合物使稻瘟霉分生孢子或菌絲形態生長異常(卷曲、膨脹、菌絲分枝過多或念珠狀等)或生長抑制與其抗真菌、抗腫瘤活性之間存在一定的相關性。因此,利用稻瘟霉這一模型篩選抗真菌、抗腫瘤活性菌株有一定的實驗依據。稻瘟霉為一種植物病原真菌,中間有2個橫隔為多細胞絲狀真菌,其個體比較大,形狀特殊,呈亞梨形,易于觀察;在沙氏培養液中進行培養只需14～16ｈ,因此非常快速;用96孔平板進行定量,操作程序簡單、易于掌握;菌種引進后由自己傳代培養,比較經濟;此外,用樣量少,重現性好,決定其作為初篩模型的優越性。稻瘟霉活性篩選指標抑制孢子芽萌發,孢子基本保持原有狀態為抑制活性,用“×”表示（a）;孢子不萌發、萌發或菌絲生長,但形態發生嚴重變化,為強變形活性,用“+++”表示(b);孢子萌發或菌絲生長,但形態發生中等強度的變化,為中等變形活性,用“++”表示(c)。菌絲生長,但生長狀態異常,為弱變形活性,用“+”表示(d);菌絲正常生長為陰性,用“-”表示(e)。稻瘟霉篩選模型的步驟將稻瘟霉接種在土豆培養基上,在27℃下培養12ｄ左右,收集分生孢子,混懸在10ｍＬ無菌水中,過濾除去菌絲體得孢子懸液,孢子懸液中加入300μＬ沙氏液體培養基后,以每孔50μＬ的量加入到96孔培養板的各孔中。將各菌株的發酵液分別過濾除去菌絲體,取50μＬ濾液分別加到96孔板的第1行各孔中(從第3列開始,第1、2列作空白對照),每1列從第1行開始依次稀釋到最后一孔(即第8行),然后27℃培養16ｈ,在倒置顯微鏡下觀察孢子及菌絲體生長形態變化情況,根據上述活性指標,判斷活性,計算最小活性濃度。鐮刀菌篩選模型中國熱帶農業科學院熱帶作物生物技術國家重點實驗室在篩選抗鐮刀菌抗生素時發現鐮刀菌也可應用于抗腫瘤、抗真菌活性物質的篩選,為此他們建立了鐮刀菌篩選模型,應用于海洋微生物抗腫瘤活性物質的篩選。鐮刀菌活性篩選指標與稻瘟霉指標相同。

植物類藥物HH、VCR、HCPT可能是通過與細胞微管蛋白結合使其不能形成紡錘體,促進微管解聚而抑制細胞周期中Ｍ期的有絲分裂。抗代謝藥物5－FU可能是通過阻礙Ｓ期的ＤＮＡ合成,從而抑制孢子萌發或使菌絲變形。烷化劑CTX、金屬絡合物DDP以及抗生素類藥物MMC則可能是通過直接破壞增殖期或Ｇo期的細胞DNA,從而影響菌絲的生長。結果表明,上述7種抗癌藥在一定程度上均影響鐮刀菌分生孢子或菌絲生長，因此鐮刀菌篩選模型可用于抗腫瘤活性物質篩選。鐮刀菌模型篩選步驟將鐮刀菌接種在土豆培養基上,28℃培養1～2周后,加入無菌水刮下孢子,搖勻過濾;以土豆液體培養基稀釋成1×104/ｍＬ孢子的孢子液,然后將50μＬ待篩樣品，分別加到96孔板,第1行各孔中(從第3列開始,第1、2列作空白對照),每1列從第1行開始依次稀釋到最后一孔(即第8行),然后在28℃培養16ｈ,在倒置顯微鏡下觀察孢子及菌絲體生長形態變化情況,根據上述活性指標,判斷活性,計算最小活性濃度。小結這幾種抗腫瘤篩選模型，具有相同的優點：靈敏度高、重現性好、用量少、費用低、操作簡便、快速、安全等特點,是很好的初篩模型,可廣泛用