啤酒發酵酵母擴培學習資料啤酒廠取得接種酵母的方式有三種方式，其優缺點見圖2.1：這三種方式是：購買酵母泥；購買純種酵母；自己保留和培育純種酵母。圖2.1啤酒取得酵母的方式和其優缺點第一節純種酵母的培育一、培育啤酒純種酵母工藝原理酵母是一種兼性微生物，這就是說，細胞的新陳代謝和繁衍即可以在有氧的狀態下也可以在無氧的狀態下進行。啤酒酵母菌的的繁衍進程分為四個階段（見圖2.7）：1．遲緩期：在此期間，雖有營養物質存在，但酵母大體不繁衍；2．對數生長期：此期間酵母繁衍最為迅速；3.穩按期：此時，代謝產物CO2和酒精的積累使酵母繁衍逐漸變慢，活菌數最高；4．衰亡期：營養物質耗盡和有毒代謝產物大量積累，酵母菌死亡率增加，活菌數減少。酵母培育中，最重要的階段是對數生長期，此時的營養、氧氣供給及其他條件如：酵母細胞濃度和溫度都必需達到最佳。酵母由于不斷地消耗氧氣，必需持續通入足夠的無菌空氣。因為氧氣缺乏時，其中一部份酵母會進行發酵，從而產生CO2和酒精，而不是產生新細胞，這樣生成的有活力的細胞數就減少了。

二、啤酒純種酵母的分離培育啤酒酵母的分離培育就是利用特殊的分離技術，將優良強壯的單細胞酵母從原菌中分離出來，加以擴大培育，供生產利用。分離培育的方式很多，工廠常常利用的是平板分離法或劃線分離法。取得原菌的方式：(1)從實驗室保留的原菌種中分離，原菌種必需先通過幾回培育活化的再行分離；(2)從生產中的酵母泥或主發酵液中分離。.平板分離培育法(又稱稀釋分離法，見圖2.2)這種方式簡單易行，適合于工廠現場利用。先將盛有麥汁的瓊脂試管培育基放在熱水中融化，冷卻至42?45C,再將準備分離培育的酵母原菌用白金針移植到已融化的培育基內。如分離培育發酵液的酵母，則先使之靜置,傾出上部清液，留少量發酵液，混合均勻后接種。如分離培育酵母泥，需加少量無無菌水或麥汁，稀釋后再接種。增殖培葬

篇被9ml無菌水\無菌水X無菌水\無的水\無茵水\將分離培育的酵母移植于融化的培育基內后，充分振蕩，使混合均勻，用白金針從該試管挑少量移植到第2支試管中，隨即將第1支試管中的培育基傾注在已滅菌的培育皿中，均勻散布在培育皿底面，使之凝固。用一樣方式再從第2支試管移植到第3支，而后第4支試管內，別離將取樣后的培育基傾注在培育皿內，如圖所示。然后，將培育皿置25?27C增殖培葬

篇被9ml無菌水\無菌水X無菌水\無的水\無茵水\圖2.2平板分離培養法.劃線分離培育法此法和平板分離法的按照是相似的，各有長處。劃線法簡單，速度較快;平板法在平板上分離的菌落單一均勻，取得純種的機率略高。用接種針挑取適當稀釋的菌液，直接在已滅菌的平面皿培育基上劃線(圖2.3),在第3或第4劃線區可能取得單一菌落。然后將所需要的菌落移植到斜面培育基上，以待進一步檢查。這個方式一般用于分離純化生產上已有的菌種。

圖2.3劃線分離培育法3,4-別離表示第1,2,3,4次劃線區.林德奈氏單細胞分離培育法（小滴培育法，見圖2.4）此法是由漢生氏單細胞分離培育法演變而來的。將準備分離培育的酵母或發酵液，移植到已滅菌的麥汁培育基中，經多次稀釋至每1滴麥汁僅含1個細胞為止。在無菌室頂用白金針取稀釋液滴在蓋玻片上，或凹形載玻片孔內，可滴3?5排，每排3?5個小點，點要均勻，距離要一致。將蓋玻片翻過來，使有小滴的一面面向凹形載玻片的孔穴，穴內加1滴無菌水，蓋玻片和載玻片間用凡士林密封。在顯微鏡下檢查每一個小滴，將只有1個細胞的小滴位置記下，如圖所示。將檢片置25?27C培育箱內，培育2?3天，天天檢查酵母細胞生長情況。小滴培育每次應做3個以上的檢片，通過培育后，加以選擇。挑選發育正常的菌落，用滅菌的三角形濾紙，把菌落吸出。移植到已滅菌的麥汁中，擴大培育，經生理特性鑒定后供生產利用。圖2.4林德奈氏小滴培育法第二節啤酒酵母的實驗室擴培啤酒酵母純正與否，對啤酒發酵和啤酒質量的影響很大。啤酒生產企業利用的酵母由保留的純種酵母，通過擴大培育，達到必然數量后，供生產現場利用鼻一個啤酒廠都應保留適合本廠利用的純種酵母，以保證生產的啤酒具有穩定的風格和特性。啤酒酵母擴大培育的順序如下：斜面試管（原菌種）一富氏瓶或試管培育一巴氏瓶或三角瓶培育一卡氏罐培育一漢生罐培育一酵母擴大培育罐一酵母繁衍罐一發酵罐。以上從斜面試管到卡氏罐培育為實驗室擴大培育階段；漢生罐以后為生產現場擴大培育階段。實驗室擴大培育酵母的順序：.斜面試管一般是啤酒工廠保藏的純粹原菌或由科學研究機構和菌種保藏單位供給。.富氏瓶培育富氏瓶內盛麥汁10mL滅菌后備用。將種酵母用白金針或巴氏滴管接種于富氏瓶內，在25?27C保溫箱中培育2?3天，天天按時搖動，使沉淀的酵母從頭散布到培育基中。同一種酵母每次培育2?4瓶，擴大時加以選擇。.巴氏瓶培育取500?1000ml的巴氏瓶，加入250?500ml麥汁，加熱煮沸，使瓶內蒸汽從側管噴出，30分鐘后，吸出彎曲管內的凝結水，塞上棉花塞，冷卻備用。在無菌室內，將試管中的酵母液由側管接種入巴氏瓶內中，在25C保溫箱中培育2天,天天檢查培育情況。為了使啤酒酵母能逐漸適應低溫環境，可將培育溫度適當調節到20C左右，但培育時間要略長一些。巴氏瓶也可用大三角瓶或平底燒瓶代替。.卡氏培育罐實驗室酵母擴培一般是利用裝5ml麥汁的容器，將酵母菌接種于此容器中。酵母繁衍分幾回進行，把處于高泡階段的培育液倒入大約10倍的容器中。為保證酵母良好快速的生長繁衍，一般擴培倍數不超過10倍。實驗室酵母擴培通常截止到不銹鋼卡氏罐，這是與生產現場擴培的連接環節。通常所用容器體積及麥汁接種量見表2.1o卡氏罐的容量：小卡氏罐8?10L,大卡氏罐20?25L。表2.1擴培容器容積與接種麥汁量容器代號123容器體積/ml101001000無菌麥汁量/ml550500接種量/ml555總量/ml555555(1)卡氏罐的外形結構(見圖2.5)451245123圖2.5卡氏罐1—空氣過濾器2—緊箍把3—絕緣手柄4一取樣閥5—帶橡皮膜的接種頭(2)卡氏罐培育酵母的操作工藝流程(見圖2.6)卡氏罐有3個緊箍使其密封，卡氏罐一般都帶有絕緣手柄、無菌空氣過濾器和取樣閥。在卡氏罐內注入麥汁，其量約為總容量的50?80%,將卡氏罐和麥汁一路加熱煮沸滅菌，然后放置于冰箱或冷房間內冷卻至接種溫度備用。在加熱滅菌時，先拔去側管的棉塞，使蒸汽從側管和彎曲管噴出30min,停止加熱，然后塞上棉塞，吸去彎曲管內的冷凝水。麥汁中增添1L無菌水，以補充水分的蒸發。大多數卡氏罐都有帶橡皮膜的接種頭,在無菌條件下通過接頭利用注射器接種。接入酵母時，接種量為100?200ml。通過取樣閥上的無菌空氣接頭，使無菌空氣通過垂直升液管從底部進入麥汁以增進酵母繁衍。若已達到期望的酵母細胞數,則將通過空氣過濾機的緊縮空氣壓入,酵母菌液從垂直液管和取樣閥被壓出,送入漢生罐。利用后,卡氏罐必需拆開用清洗劑進行人工清洗,并于利用前檢查過濾器是不是清潔和完好。卡氏罐一般接入1?2個巴氏瓶的酵母液，搖動混合均勻后，置于15?20℃下保溫3?5天，即可進行擴大培育，或可供約100L麥汁發酵用。一般情況下，卡氏罐的最大工作壓力為0.2MPa。（3）卡氏罐的長處麥汁殺菌可利用殺菌鍋,也可利用燃氣爐或電熱爐代替；適于麥汁通氧；給酵母轉移提供了安全的條件；較易清洗；運輸方便。麥汁量大時,不能在實驗室進行酵母擴培,因為送輸很困難。因此,需要在車間的酵母擴培設備中繼續進行擴大培育。加熱圖2.6卡氏罐酵母培養流程5．實驗室擴大培育的技術要求（1）一切培育用具必需完全刷洗干凈,塞好棉塞,干熱滅菌,滅菌溫度170℃左右；（2）培育用的培育基,應利用現場加酒花的麥汁,加熱煮沸并加蛋白澄清,利用蒸汽間歇滅菌后，在25℃保溫箱中貯存2?3天，證明無污染后，方可利用；（3）每次擴大稀釋倍數約10倍以下；（4）每次移植接種后,要鏡檢酵母細胞的發育情況；（5）隨著每階段的擴大培育,培育溫度慢慢降低,以適應現場發酵情況；（6）每一個擴大培育階段，均應做平行培育：試管4?5只，巴氏瓶2?3個，卡氏罐2個,選擇優者進行擴大培育。圖圖2.8傳統開放式酵母擴培第三節啤酒酵母的車間擴培卡氏罐培育后，酵母進入現場擴大培育。酵母擴大繁衍的方式可按照工廠具體條件進行。啤酒廠一般都有漢生(Hansen)罐培育設備，可持續利用1株酵母，反復多次擴培而不需換種，直至酵母出現衰退和染菌等異樣情況。酵母生理狀態與擴培工藝之間的關系見圖2.7o細胞數穩定期同化法L聯統酵母擴培圖2.7酵母生理狀態與擴培工藝之間的關系一、開放式酵母擴培生產規模較小的啤酒廠一般不配置專用的酵母純種擴培設備，有的往往直接從大啤酒廠購買酵母泥。以這種方式進行生產，雖然啟動生產很方便，但由于容器衛生和運輸問題,實際上很難保證酵母的衛生和質量。在這種情況下，啤酒廠可自行實施酵母的簡易擴培。.傳統的開放式酵母擴培方式(見圖2.8)其工作方式與實驗室的擴培大致相同。從試管到小三角瓶，再從小三角瓶到4X5L的大三角瓶，酵母數量慢慢擴大。最后用帶蓋的、容量約200L的金屬容器進行擴培，然后進入生產，在較小的發酵池中繼續增殖和發酵，其參數見表2.2。表2.2發酵池體積與接種酵母液量采用這種方式進行擴培，人們很方便地就可以夠將酵母培育液擴大化至5噸。從試管到三角瓶的酵母培育要利用無菌麥汁，以后的培育進程則全數利用生產麥汁。.小罐式酵母擴培方式這種擴培方式是，酵母在一個容量為40L、且容易清洗的金屬罐中增殖培育。按照生產規模，也可利用多個罐。但其中一個必需作為原種罐，用于下一次擴培。此種方式簡單、方便，是一種很實用的酵母擴培方式。工作方式如下（見圖2.9）：圖2.9罐式酵母擴培1-40L罐中接種25L嫩啤酒2—純種培養池將一個罐完全清洗干凈，用蒸汽滅菌，然后接入20L經高溫滅菌的無酒花麥汁，在大約20C的溫度下，酵母很快增殖，并形成豐碩的泡沫。這時，把罐中的酵母培育液別離加入到另外4個已注入20L冷卻麥汁的罐中，通過大約2?4天的培育后，各個罐中的酵母培育液已達到高泡階段。這時，應及時將3個罐中的酵母培育液（約60L）倒入已完全清洗滅菌的純種培育池中。第四個罐中的酵母培育液則用于下一批次的擴培接種。此進程可在一按時間內重復進行。二、密閉式酵母擴培方式最近幾年來的現代化酵母擴培設備都是在漢生罐的基礎上加以改良的，它由不同規格的密閉式不銹鋼容器組成的，擴大培育在密閉系統中進行,直至達到發酵罐所需的酵母添加量。由于企業實際情況不同，酵母擴培的要求也不盡相同，其設備及擴培方式也出現了許形式，本書主要介紹典型的漢生罐培育法、一罐法、兩罐法和持續增殖法。.漢生罐培育法漢生罐培育系統由1個麥汁殺菌罐和1?2個酵母培育罐組成，容積為200?300L,各罐都具有夾套，可以進行殺菌、冷卻和保溫，罐上裝有手搖攪拌器或以通風攪拌。啤酒廠普遍應用的漢生罐酵母擴培工藝方式如下:

斜面25℃"10ml試管斜面25℃"10ml試管23℃*50ml三角瓶培養21℃*500ml三角瓶培養19℃*3000ml三角瓶培養17℃15L卡氏罐培養250L漢生罐培養1t1000L增殖罐培養*4000L擴大罐培養15℃13℃11℃9℃實驗室按5?10倍擴大培育，現場按3?4倍轉接，培育到對數生長期結束前2?3小時為止，出芽率為75?85%。操作流程：（1）在無菌條件下，用無菌空氣將卡氏罐中的酵母壓入滅菌后漢生罐，通風5?10分鐘。（2）同時將麥汁加入麥汁殺菌罐中，進行滅菌，冷卻后打入已加入酵母的漢生罐。（3）維持品溫10?13℃,培育36?48小時，此期間每隔數小時通風10分鐘。（4）待培育液進入對數生長期后，將其中85%的酵母移植到下一級擴大培育罐，最后逐級擴培到必然數量，供現場發酵利用。（5）漢生罐中剩余15%酵母培育液，加入滅菌冷卻后的麥汁，待起發后，冷卻備下次擴培利用。漢生罐內保留的種酵母，應每一個月換一次麥汁，并檢查保留的酵母是不是正常，有否污染和變異。正常情況下此種酵母可持續利用半年左右。.一罐法顧名思義，這種方式只利用一個擴培罐。擴培罐帶有加熱和冷卻夾套（見圖2.10）。它的主要特點是，在擴培進程中，要不斷補充麥汁，一般不對麥汁進行二次滅菌；擴培結束后的酵母液并非全數打出進入發酵生產，而是保留一部份酵母液在擴培罐中，這部份培育液作為下一批次擴培的接種酵母利用。一罐法酵母擴培的關鍵是，要在酵母的對數生長期進行分割。一罐法酵母擴培的第一步是將大約1/3的麥汁送入通過嚴格清洗和滅菌的擴培罐中。然后，借助無菌空氣經取樣閥將卡氏罐中的純種酵母（約6?7L）壓入擴培罐。接著開泵循環、通風，并按照需要進行冷卻。擴培至高泡期即酵母的對數生長期時，再補充約1/3的麥汁，繼續培育。當再次達到高泡期時，補充最后約1/3的麥汁。通過持續48小時的培育后，擴培結束，將大部份的擴培酵母液泵入發酵罐。剩余酵母則保留在擴培罐內，作為下一次擴培的接種酵母。通過一段時間的利用后，要將設備放空，進行完全的清洗和滅菌。用這種相對簡單、經濟的方式，1噸原接種麥汁量在一周內可繁衍酵母接種100噸麥汁。然財口然財口一罐法的長處是設備簡單，投資低，酵母能夠在最短時間內取得快速生長。借助控制系統可以維持恒定的條件，從而生產出質量恒定的擴培酵母。但這種方式存在微生物染菌的風險，因為無法對麥汁進行殺菌。由于在擴培罐中始終保留部份酵母作為接種酵母，酵母可能由于突變失去某些特性。3．兩罐法兩罐法是一種傳統的酵母擴培方式，在每次擴培的起始階段通風。酵母不僅處于好氧狀態，還處于厭氧狀態（猶如后續的發酵進程），即酵母必需適應厭氧環境進行物質互換而獲取較低的能量，其擴培倍數較低，一般為3.5?4倍。兩罐法的特點是，每次培育都需要實驗室純種酵母接種，通過生產擴培用于生產后，對系統進行完全排空并殺菌，進入下一個培育進程。兩罐法擴培系統（見圖2.11）主要由預擴培罐（小罐4hl、5hl、6hl）、主擴培罐（大罐40hl、50hl、60hl）、循環泵、酵母輸送、酵母添加、CIP入流和CIP回流組成。另外，還包括產品分派接管盤、本身的CIP裝置和管道和控制柜。擴培工藝流程如下：（1）將小罐接滿麥汁；（2）將小罐中的麥汁進行殺菌；（3）將殺菌后的麥汁冷卻至接種溫度；（4）將卡氏罐的菌種接到小罐中；（5）在小罐中進行酵母擴培；（6）將大罐接滿麥汁；（7）將大罐中的麥汁進行殺菌；（8）將殺菌后的麥汁冷卻至接種溫度；（9）將小罐和大罐間的管線進行殺菌；（10）將小罐中的酵母倒入大罐中；（11）在大罐中進行酵母擴培；（12）連接大罐至發酵罐間的管線；（13）對管線進行CIP清洗和蒸汽殺菌；（14）將大罐中的酵母液倒入發酵罐；（15）對酵母擴培系統進行CIP清洗，整個擴培進程結束，開始下一次酵母擴培。兩罐法是一種獨立的、封密式的系統，通過麥汁殺菌保證不會出現染菌情況。自動化控制系統可以靈活地調整溫度、通風和培育時間。使能生產的酵母質量均一。但兩罐法的設備購買費用較高，刷洗和操作比較復雜。圖圖2.12酵母連續增殖擴培系統圖2.11兩罐法酵母擴培系統4.持續增殖法其工藝流程：首先把麥汁裝入麥汁滅菌罐中，在100℃時滅菌至少30分鐘，麥汁冷卻至14?16℃備用。然后，在無菌條件下將卡氏罐中的酵母添加到小的增殖罐中，接著將麥汁從滅菌麥汁罐中泵入增殖罐，達到所需容積后，再進行循環并同時通風（見圖2.12）。容積測量利用稱量裝置進行。為使酵母加速增殖，麥汁必需強烈通風。大約一天以后（24?36h）,即培育液達到高泡期時，在無菌條件下將小增殖罐中的培育液泵入下一個較大的增殖罐中。該進程持續進行至達到所需的酵母量為止。最后，當增殖罐中達到最高酵母量時，將正處于高泡期的嫩啤酒泵入發酵罐中進行發酵。為確保最佳的發酵，在發酵罐中需再次強烈通風。增殖罐中要保留必然量的高泡殘液，并當即加入無菌麥汁，以開始下一次酵母增殖。清洗增殖罐之前，要把增殖罐中的內容物全數排空。利用這種追加式的酵母擴培方式在實際生產條件下，可在較短時間距離內持續進行純種擴培，由此達到均勻的酵母質量。三、純種酵母擴培存在的問題酵母擴培實際上是一個綜合概念，在不同方面存在著各類觀點。因此，有必要進一步考慮常常出現的問題。1．酵母擴培裝置的設計要求為了達到酵母擴培的目的，即在最短時間內取得細胞數高、質量均一的酵母，在設計酵母擴培裝置時，必需使其與啤酒廠具體工作條件相適應。酵母擴培裝置的大體要求如下：（1）達到足夠量的通風和氧氣飽和，至于采用持續或中斷方式，取決于相應的通風循環；（2）在擴培罐中進行均勻的混合和散布，保證酵母細胞、麥汁和氣泡之間的猛烈接觸；（3）在擴培階段和在擴培結束冷卻到接種溫度時適當進行溫度控制；（4）在良好的微生物條件下擴培；（5）適合的測量和調節技術，保證可再現的流程。2．酵母擴培中的酵母管理Wackerbauer教授曾簡明扼腹地描述了酵母擴培的根本任務：“在無菌條件下和最短時間內生產盡可能多的酵母”。良好的酵母管理可以確保發酵和儲酒階段完美的進程，從而保證順暢的啤酒生產。應該在完美的微生物條件下和最短時間內生產出質量均勻的酵母，所生產出的酵母應該具有很高的發酵能力、較低的死酵母數（＜1%）,細胞數介于0.1?0.15億個/ml。良好的發酵管理對發酵進程、后熟、啤酒的可濾性、抗染菌能力和啤酒質量具有特別踴躍的影響。3．是不是有必要對麥汁再次殺菌有些啤酒廠的擴培罐雖然帶有麥汁加熱裝置，但在實際生產中不對麥汁進行再次殺菌。建議在去酵母間的管道上安裝熱互換器對麥汁進行巴氏殺菌。固然，是不是進行殺菌，還取決于各個啤酒廠的工作條件。4．肯定數量的最適合方式大體上存在三種可能性：壓差測量、稱重和流量測量。采用壓差測量時，必需把底部的壓力傳感器放在適合的位置上，不然將致使在顯示裝置上出現壓力波動。選擇測量儀器時，必需保證在較低數量下也能作出反映。計量稱可以準確地肯定重量。但必需采用彈性連接，管道連接處不能受力，這對機械連接和結構提出了更高的要求，投資費用也比較高。若是肯定采用流量測量，必需注意，不能使混合物中存在氣泡和泡沫，必需考慮適合的流量計。5．對酵母進行通風通入無菌空氣，一方面為了補充所需要的氧氣，另一方面為了排除產生的二氧化碳氣體。在實際生產中，可以采用不同的通風方式。實際工作中常常采用的通風方式有：（1）每5分鐘通風1分鐘；（2）在前24小時內每15分鐘通風1分鐘，在后24小時每5分鐘通風1分鐘；（3）通風量最高為120升/分，使麥汁中的氧含量達到10?15mg/L。6．最佳擴培溫度建議在擴培開始時維持在15℃，然后緩慢降溫到10℃（實際生產中，常常把擴培溫度維持在20℃，擴培結束時冷卻至接種溫度）。7．對酵母起泡采取的辦法為了減少泡沫的形成，有些資料中談到了在擴培罐中安裝分派帽。這是一種簡單實用的設計，可以避免在擴培罐中出現附件。8．應該達到多少細胞數傳統擴培的目標是達到0.8?1.0x108個/ml細胞數。細胞數不能超過1.5X108個/ml,不然，由于受到麥汁中營養成份的限制，將致使酵母的營養不良。9．酵母擴培質量酵母數不能超過1.5X108個/ml。必需注意，接種酵母中的死細胞數不能＞1%,接種濃度介于0.8?1.0X106個/ml麥汁。同化結束時應達到以下指標：pH值3.8?4.2,乙醇含量為1.0?2.0%（重量比），二氧化碳含量0.5?1.5g/kg。死細胞數低于1%（甲基蘭）。10．同化的取歷時間按照各項報告表明，可以在24小時后取用整體積的80?85%。如能維持酵母擴培的流程條件,可以維持24小時的循環周期。在實際生產中,通常不準確區分各類方式,完全可利用各類轉變方式,這取決于各個企業的具體生產條件。需要特別肯定的參數包括擴培溫度、通風時間和通風距離、麥汁添加量和生長的時間階段。這樣,用兩罐法時也可以將酵母生長維持在一罐法的對數生長階段。四、酵母擴大培育的幾項原則1．菌種條件酵母擴大培育的關鍵在于利用優良的單細胞動身菌。此動身菌應先經生理特性和生產性能鑒定,然后投入應用,并保證在擴大培育進程中無污染、無變異。每一步擴大后的殘留液都應進行無污染和無變異的檢查。2．培育溫度培育前