ICS65.020.40CCSB6144廣 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB44/T2346—2021木麻黃青枯菌強(qiáng)致病性菌株篩選技術(shù)規(guī)程TechnicalregulationsonscreeningstrainsofRalstoniasolanacearumwithhighpathogenicitytoCasuarinaspp.20212021120720220307廣東省市場監(jiān)督管理局??發(fā)布DB44/T2346DB44/T2346—2021DB44/T2346DB44/T2346—2021目 次前言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1原理與方法 1儀器用具 2培養(yǎng)基與試劑 2病菌分離與純化 2檢測鑒定 3菌株鑒定 5強(qiáng)致病性菌株篩選 5菌種保存 5附錄附錄A（資料性）木麻黃青枯菌 6附錄B（規(guī)范性）培養(yǎng)基及試驗(yàn)方法 7附錄C（規(guī)范性）試驗(yàn)調(diào)查表格 11I前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由廣東省林業(yè)局提出、歸口，并組織實(shí)施。本文件起草單位：廣東省林業(yè)科學(xué)研究院。本文件主要起草人：許秀玉、黎明、余玉娟、徐斌、甘先華、王明懷、張應(yīng)中、張衛(wèi)強(qiáng)。IIII木麻黃青枯菌強(qiáng)致病性菌株篩選技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了木麻黃青枯菌分離與純化、檢測鑒定方法、菌株鑒定、強(qiáng)致病性菌株篩選及菌種保存等技術(shù)要求。本文件適用于木麻黃屬植物強(qiáng)致病性青枯菌菌株的篩選。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB4789.28-2013食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。下列術(shù)語和定義適用于本文件。青枯菌病害英文名：BacterialwiltofCasuarinaBacteriaProteobacteria，-BetaproteobacteriaBurkholderialesBurkholderiaceae，青枯。病原菌通過根部從病株蔓延至健株，通過土壤、水流進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。木麻黃青枯菌的其他信息參見附錄A。強(qiáng)致病性Strongpathogenicability能讓木麻黃植株迅速感病死亡的能力。褐梗小枝Brownlignifiedtwigs基徑2mm～5mm的褐色木質(zhì)化小枝，具多分枝。分枝Branch生長在小枝上的綠色枝條。小苗seedling無性系苗或?qū)嵣纾?0cm～70cm高。4原理與方法1儀器用具儀器（精度≤0.0001g）（具照相系統(tǒng)（≥12000PCR（30～95用具鑷子、手術(shù)剪、解剖刀、量筒、燒杯、培養(yǎng)皿、三角瓶、離心管、試管、接種針、接種環(huán)等。培養(yǎng)基與試劑培養(yǎng)基CPG培養(yǎng)基：按附錄B中的B.1規(guī)定執(zhí)行。CPG培養(yǎng)基：按附錄B中的B.1規(guī)定執(zhí)行。TTC培養(yǎng)基：按附錄B中的B.2規(guī)定執(zhí)行。試劑革蘭氏染色試劑：按附錄B中的B.3規(guī)定執(zhí)行。PCR檢測所需試劑：按附錄B中的B.4規(guī)定執(zhí)行。2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）7病菌分離與純化病株判斷樣本采集0.5cm～1.5cm2段～310cm～20cm，封口袋封裝，記錄采集時間、地點(diǎn)，帶回實(shí)驗(yàn)室分離病菌。病菌分離7.3.1稀釋分離法2取病根（約3cm），自來水洗凈，75％的酒精浸泡消毒30s，置無菌水沖洗3次，每次30s，在超凈工作臺上剝?nèi)ネ馄ぃ糜跓o菌培養(yǎng)皿中切除兩端，最后將其橫切成3份～5份，放入含有5ml～10ml無菌水的培養(yǎng)皿內(nèi)30min，攪拌形成病菌懸浮液。用接種環(huán)蘸取菌液在TTC培養(yǎng)基平板上劃線分離，至少3個平板，編號，于30℃下恒溫培養(yǎng)24h～48h。7.3.2根系溢出法將8cm～10cm長的病根洗凈，兩端切成平整的新鮮斷面，把其中一端浸泡于裝有無菌水中的玻璃瓶中，室溫放置12h～36h后，在病根的另一端斷面會流出乳白色的菌膿。用接種針挑取菌膿劃線培養(yǎng)于TTC培養(yǎng)基平板上，至少3個平板，編號，置于30℃下恒溫培養(yǎng)24h～48h。病菌純化在培養(yǎng)皿內(nèi)挑取不規(guī)則圓形，乳白色、中心部位粉紅色，具有流動性的單菌落，接種于TTC培養(yǎng)基平板上，30℃條件下擴(kuò)大培養(yǎng)36h～48h，每個菌落接種3個培養(yǎng)皿并編號。病菌培養(yǎng)固體培養(yǎng)接種于TTC或CPG固體培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)24h～48h。液體懸浮培養(yǎng)將分離純化后的青枯病菌接種于三角瓶中，CPG液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基體積不超過三角將分離純化后的青枯病菌接種于三角瓶中，CPG液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基體積不超過三角瓶容積的1/2，150r/min～200r/min，30℃條件下培養(yǎng)12h～24h。8檢測鑒定菌落特征在TTC（有的中央部位出現(xiàn)螺旋樣紅色沉著），不透明，具有流動性。形態(tài)特征青枯菌菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，大小為（1.5m～2.5m）×（0.5m～0.7m），多數(shù)無鞭毛，少數(shù)具1根～3根極生鞭毛，無芽胞，無莢膜。革蘭氏染色按GB4789.28-2013中的方法進(jìn)行革蘭氏染色反應(yīng)。若革蘭氏染色呈陰性，則進(jìn)行下一步檢測。16SrRNA測序鑒定從分離的菌株中提取DNA擴(kuò)增青枯菌16SrRNAbp。PCR產(chǎn)物回收后測序、比對，具體檢測方法步驟按附錄B中的B.4規(guī)定執(zhí)行。LAMP快速檢測3C4LAMPF3（5-CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3）和 B3（5-ACCGCAACACGGGATCA-3）為外側(cè)引物，F(xiàn)IP（ 5-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT-3 ） 和 BIP（5-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3）為內(nèi)側(cè)引物。LAMP反應(yīng)結(jié)束后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，具體檢測方法步驟按附錄B中的B.5規(guī)定執(zhí)行。致病性測定褐梗小枝水培接種材料選擇對青枯病抗性具有差異的木麻黃無性系，如A13與K18（感病），G1與30（抗病）等。方法恒溫水培接種法，具體操作方法按附錄B中的B.6規(guī)定執(zhí)行。相對病害強(qiáng)度分級標(biāo)準(zhǔn)相對病害強(qiáng)度分級標(biāo)準(zhǔn)如下：00；22；322；33。病情指數(shù)病情指數(shù)是全面考慮發(fā)病率與嚴(yán)重度的綜合指標(biāo)。病情指數(shù)按式（1）計算。I楰Σ (N×G)ki??i iGk×Nt×式中：ID——病情指數(shù)；Ni——各級病級分枝數(shù)；Gi——各級病級相應(yīng)級數(shù)值；Gk——最高級數(shù)值；Nt——調(diào)查總分枝數(shù)。小苗盆栽接種材料選擇對青枯病抗性具有差異的木麻黃無性系，如A13與K18（感病），G1與30（抗病）等。方法移栽浸根接種法，具體操作方法按附錄B中的B.7規(guī)定執(zhí)行。死亡率計算4以株為單位調(diào)查，記錄無病植株與死亡植株數(shù)。死亡率按式（2）計算。×P?楰 1??% (1)×N式中：P——死亡率；D——死亡植株數(shù)，單位為株；N——調(diào)查總株數(shù)，單位為株。菌株鑒定分離純化得到的細(xì)菌菌株符合以下幾方面的檢測結(jié)果，則可以判定為青枯菌菌株。TTC革蘭氏染色反應(yīng)呈陰性。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果與已知的16SrRNA基因序列同源性達(dá)99%以LAMP強(qiáng)致病性菌株篩選符合以下兩個方面的檢測結(jié)果，則可以判定為青枯菌強(qiáng)致病性菌株。7070%以上。菌種保存蒸餾水保存法108cfum4℃恒溫冰箱中臨時保存，保存時間不超過1周。甘油液保存法將純甘油配制成50%-2050%甘油與菌液按2:1比例混合，劇烈震蕩，充分混勻，置-20-803年左右。液氮超低溫保存法冷凍干燥保存法1h～2h，再將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)開始冷凍干燥8h～20h，可保存10年以上。5附錄 A（資料性）木麻黃青枯菌地理分布亞洲、歐洲、非洲、北美洲、南美洲均有分布；我國主要分布于福建、廣東、廣西、海南、浙江、江蘇、湖北、湖南、江西、云南、貴州、四川、重慶、山東、河南、河北、安徽、北京、天津、上海、臺灣。寄主范圍該病菌可侵染茄科、豆科、芭蕉科等54個科的450余種植物，主要有：木麻黃、桉樹、番茄、馬鈴薯、茄子、煙草、香蕉、海里康、桑樹、龍葵、辣椒、花生、芝麻、甘薯、油橄欖和姜等。病株癥狀病原菌形態(tài)特征生物學(xué)特性病菌呈短桿狀，兩端鈍圓，大小為（1.5病菌呈短桿狀，兩端鈍圓，大小為（1.5m～2.5m）×（0.5m～0.7m），多數(shù)無鞭毛，少數(shù)具1根～3A.5木麻黃青枯病病害流行規(guī)律6附錄 B（規(guī)范性）培養(yǎng)基及試驗(yàn)方法CPG（Casaminoacid-Peptone-Glucose）培養(yǎng)基蛋白胨10g，酪朊水解物1g，葡萄糖5g，蒸餾水1000ml，瓊脂17g（配制液體培養(yǎng)基時不加入瓊脂），調(diào)節(jié)PH至7.0，121℃濕熱滅菌20min。TTC蛋白胨10g，酪朊水解物1g，葡萄糖5g，蒸餾水1000ml，瓊脂17g，調(diào)節(jié)PH至7.0，121min后，溫度降至502,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）0.05mg/L。革蘭氏染色法結(jié)晶紫染色液結(jié)晶紫1.0g，95%乙醇20.0ml，1%草酸銨水溶液80.0ml，將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。革蘭氏碘液碘1.0碘1.02.0300.0ml。沙黃復(fù)染液沙黃0.25g，95%乙醇10.0ml，蒸餾水90.0ml，將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。染色法染色步驟如下：1min，水洗；1min，水洗，用吸水紙吸去水分；9530s；或?qū)⒁掖嫉螡M整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個涂片，10s。水洗，吸去水分；1min，自來水沖洗；干燥，鏡檢；（G）（G）。PCR細(xì)菌DNA模板的制備無菌操作下，將純化后的待測菌制成菌懸液，或取可疑植物組織，按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒方法提取基因組DNA，測定DNA濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ颫LI1：5-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-37Y2：5-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3PCR反應(yīng)體系體系為25μL1×PC緩沖液20mMTri-HCpH8420mMKC10mM(N)S，1.5mMMgC）0.2mMdNTP0.2mM1μ，Ta酶1U2L，加ddO25L。PCR反應(yīng)條件變性：962min。三溫循環(huán)：9420s；6820s；72℃，30s。50個循環(huán)后，72PCR結(jié)果判定2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR280bp左右的PCR測序?qū)CR（測序可由生物公司完成測序引物為OLI1、Y2。比對測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有青枯菌菌株的16SrRNA基因序列進(jìn)行比對，同源性99%以上時將該病原菌鑒定為青枯菌。LAMP細(xì)菌DNA模板的制備按附件B中的B.4.1規(guī)定執(zhí)行。引物設(shè)計和合成CPrierExlorrVesion4.（htp:/priereploer.p/e）在線設(shè)計4條LAMP特異性引物，其中F3（5-CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3）和B3（5-ACCGCAACACGGGATCA-3）為外側(cè)引物，F(xiàn)IP（5-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT-3）和BIP（5-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3）為內(nèi)側(cè)引物。LAMP42 4 LAM25μFI和BI1.6mol·F3B30.2molLdNT1.4mmlL1.0mo20moL1Tri-HC，10mmoL1(NH)SO，50mmolL1KC，6mmlL1MgSO，0.1%Twen-2），模板DN42 4 1μL，然后加入82.0DNA聚合酶，補(bǔ)水至25μL。混勻離心后，6345min。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測反應(yīng)前在PCR管內(nèi)蓋上加入1μLSYBRGreenⅠ熒光染料，反應(yīng)結(jié)束后瞬時離心，將染料與反應(yīng)液混勻后觀察顏色變化，若反應(yīng)管中有青枯菌DNA的大量擴(kuò)增，則反應(yīng)管顏色呈現(xiàn)綠色，反之為橙色。8恒溫水培接種法試驗(yàn)設(shè)計無性系與菌株的雙因素交叉試驗(yàn)。每個無性系與每個菌株的一次試驗(yàn)為一個處理。植物材料15cm～20cm木麻黃褐梗小枝，每個褐梗小枝含有8個～10個分枝。每個處理需要3段～4段褐梗小枝（共包含約30個分枝）。菌株經(jīng)分離純化、鑒定后的青枯菌菌株作為測定菌株。操作方法各處理將3段～4段褐梗小枝浸入盛有200ml細(xì)菌懸浮液（4×108cfu/ml）的玻璃瓶內(nèi)，每個處理重復(fù)3次，無菌水作對照。培養(yǎng)條件將各處理置于溫度30℃，相對濕度80%，光照時間16h，強(qiáng)度為8000Lux的人工氣候箱中培養(yǎng)。B.6.6觀察記錄B.6.6觀察記錄連續(xù)觀察5d以上，每天記錄植株發(fā)病情況，利用第5d數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。移栽浸根接種法試驗(yàn)設(shè)計無性系與菌株的雙因素交叉試驗(yàn)。每個無性系與每個菌株的一次試驗(yàn)為一個處理。植物材料6個月齡期、50cm～70cm高、根系發(fā)達(dá)、生長一致的無性系營養(yǎng)袋苗。菌株經(jīng)分離純化、鑒定后的青枯菌菌株作為測定菌株。操作方法抖落苗木土壤，洗凈根部，除去基部黃化葉片，剪去1/3根系，浸入配制好的細(xì)菌懸浮液（4×108cfu/ml）中，30℃～31℃保濕浸根培養(yǎng)30min，然后種植于裝有草木灰與黃心土（體積比為1:2）的塑料盆中。草木灰與黃心土提前3d裝好，攪拌均勻，并用3%高錳酸鉀淋透消毒。每個處理一盆，每盆種植20株～25株，每處理重復(fù)3次，無菌水作對照。培