關于放射免疫分析技術第1頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四一、基本概念放射免疫測定（RAI）：根據抗原抗體特異性結合的原理，以放射性同位素標記抗原或抗體，根據射線的多少定性或定量測定待檢標本中抗體或抗原的量。同位素（isotope）：元素周期表中處于相同位置的某種元素所包含的若干種核素。放射性核素（radionuclide）：由于核內中子數和質子數的比例不適而自發地發生核衰變，在衰變過程中將放射出一種或幾種射線而轉變為別種核素的不穩定核素。第2頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四1959年Yalow和Berson建立放射免疫測定（RIA）1960年競爭性蛋白結合分析（CPBA）1968年Miles和Hales建立免疫放射量度分析（IRMA）1968年放射受體分析法(RRA)1971年Addison和Hales建立雙位點或夾心IRMARIA方法學研究進展第3頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四基本原理：放射性標記的已知抗原（*Ag）和非標記的待檢抗原（Ag）同時與限量的特異性抗體進行競爭結合或競爭性抑制反應，通過測定結合（*Ag-Ab）的或游離（*Ag）的放射性標記抗原的量，根據標準曲線即可推算出被測物含量的一種超微量分析技術。RAI屬超微量分析技術，常用于胰島素、生長激素、藥物等微量物質的測定。二、RIA原理第4頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四Ag

*AgAbBoundFree

BFB/F10.500.500.670.3320.50.330.670.20.170.83競爭放射分析原理示意圖第5頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四常用標記放射性同位素及其性質放射性元素半衰期射線種類及能量（百萬電子伏特）βγ

14C5720年0.155－

3H12.5年0.0189－

125I60天－0．035

131I8.05天0.608，0.335，0.2500.364，0.637，0.722第6頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四125I的優點29種同位素，125I最為常用；

半衰期適中(60天)，易于商品化和儲存，也利于廢物處理；發射低能35kV

γ線易于測量，井型閃爍效率高；不發射β粒子，標記物自分解速度低；標記過程中，標記物免疫損傷小；化學性質活潑，標記Ag和Ab容易，可得到多種標記物而廣泛應用。第7頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四放射性核素標記物制備的主要方法氯胺T法活化NaI中放射性碘離子乳過氧化酶法催化過氧氣化氫釋放新生態氧，使125I離子活化雙酶標記法葡萄糖氧化酶提供過氧化氫作為乳過氧化酶底物氯甘脲標記法活化NaI中放射性碘離子第8頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四放射性同位素標記化合物的純化方法凝膠過濾法分離標記蛋白與無機碘離子交換法用于分離純化短肽標記物透析法將標記蛋白與小分子化合物很好地分離電泳法分離單碘化、多碘化及已受損傷的蛋白質親和層析法利用特異抗體或受體結合分離、純化標記蛋白質高效液相層析法分離效果好、快速ConA吸附法分離標記糖蛋白第9頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四二、RIA操作程序配制已知濃度系列標準抗原（Ag）加待測抗原（Ag）和抗體（Ab）--溫育加標記抗原（*Ag）和抗體（Ab）--溫育分離復合物*AgAb（B）和游離*Ag（F）用γ計數器測量放射性計數根據標準曲線或計算機直接算出第10頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四5.測量4.去上清分離立即1.加樣1.樣品或標準品2.標記物3.抗血清混勻溫浴2.加分離劑分離劑混勻3.離心第11頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四動態平衡體系中:*Ag與Ag具有同樣的免疫活性和結合反應能力*Ag和Ab的量恒定Ag+*Ag的分子數大于抗體的分子數*Ag與Ag相互競爭同Ab結合，彼此抑制，待測Ag與*AgAb呈負相關函數關系測抗原（Ag）和抗體（Ab）--溫育第12頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四沉淀法加涂有右旋糖酐的活性碳（DCC）吸附小分子F，離心吸附法調pH值于γ球蛋白等電點，加入適當濃度PEG或中性鹽過濾法小分子游離的放射性物質F被抽吸通過濾膜而分離雙抗體法固相法SPA法入第二抗體，形成第二抗體復合物，離心抗體或抗原固相化，免疫反應在固相載體上完成后洗滌金黃色葡萄球菌A蛋白促使AgAb較快速度沉淀結合抗原(B)與游離抗原(F)分離方法第13頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四三、RIA法標準曲線標記抗原與被測物質間的數量關系可以用抑制曲線來表示。這種曲線表示了結合抑制的程度與抑制物濃度兩者之間的特定函數關系，也稱為劑量反應曲線。標準曲線的手工繪制形態標準曲線的形態可因所用的反應變量表達形式的不同，或所采用坐標系統不同而有不同的形態。標準曲線的基本數學函數式放射免疫分析從抗原抗體反應動力學分析，反應是雙向性的，服從質量作用定律。第14頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四

7550301001101001000未標記抗原濃度（ng/ml)結合/未結合的放射活性（%）待測Ag與*AgAb呈負相關函數關系第15頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四RIA競爭抑制曲線類型注：橫坐標為標記抗原（*Ag）的濃度第16頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四四、建立放射免疫分析方法的必備條件對標準抗原的基本要求(1)標準抗朱與待測抗原的免疫性必須一致。

(2)抗原必須純度高。

(3)標準抗原的量必須準確。

(4)標準抗原應有很好的穩定性。對抗血清的要求抗血清中含有對其相應抗原的特異性抗體。檢查抗血清質量的指標主要有親和常數(K)、免疫交叉反應率及滴度(或抗體效價)。對標記抗原的要求(1)標記抗原的免疫活性與待測抗原及標準品必須一致。(2)標記抗原要有適當高的放射性比活度。(3)標記抗原應具有足夠高的放射化學純度第17頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四衡量抗體質量的指標親和力:抗體結合的強度是RIA的前提特異性:不受交叉反應物質影響的程度滴度:抗體的效價——抗體實際應用時的稀釋倍數第18頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四斜率＝－KAB/F301Ag-Ab濃度親和力測定（Scatchard作圖）第19頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四

100

500123456復合物放射性Log競爭劑濃度特異性的測定－－交叉反應檢測交叉反應率＝A50/B50×100％ABC第20頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四B%

100806040200100100010000100000抗血清稀釋度抗體滴度測定第21頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四五、放射免疫分析的設計方法◆標譏抗原和抗體用量最佳化設計:1、標記抗原用量選擇。2、抗血清的使用滴度選擇及其方法。◆標準抗原劑量設計1、標準抗原劑量范圍2、標準曲線工作范圍◆加樣順序設計◆反應介質◆反應容積與溫度及時間1、縮小反應容積可相應減少抗體和標記抗原的絕對用量，使非標記抗原的競爭力相應增強，有利于提高靈敏度。

2、抗原、抗體結合反應的平衡結合常數K與溫度有關，必須通過實驗來確定最佳工作條件。◆與F分離方法選擇◆樣品采集與保存第22頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四六、放射免疫分析的質量控制◆誤差和放射免疫誤差的來源(1)誤差及其分類

(2)放射免疫分析誤差來源◆掌握質量控制與質控樣品(1)放射免疫分析的質量控制內容

(2)質量控制樣品◆質量控制指標：靈敏度、精密度、偏倚和準確度、特異性、穩定性、臨床有效性。◆實驗室內部質量控制：精密度的評價、批內偏倚的評價和批間重現性評價。◆實驗室間的外部質量評價。第23頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四(一)、液相法已知放射標記抗原待檢非標記抗原+抗原抗體抗原抗體結合+分離沉淀物抗原抗體復合物上清液中游離抗原七、RIA技術類型和應用第24頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四1.直接法IRMA示意圖標記抗體抗原固相抗原離心測定（二）、固相法第25頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四2.雙位點法IRMA示意圖測定標記抗體洗滌抗體抗原第26頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四八、免疫放射分析（IRMA）基本原理：用過量的核素標記抗體與待測抗原形成復合物，并用固相免疫吸附劑作為B或F的分離手段除去多余的游離抗體，測量抗原抗體復合物的放射性。Ag

*Ab

Ag*Ab第27頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四固相抗體抗原過量的標記抗體抗原固相抗原過量標記的抗體雙位點IRMA

單位點IRMA

第28頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四結合率（%）Ag劑量RIAIRMA和RIA曲線形態比較結合率（%）Ag劑量IRMA第29頁，共32頁，2022年，5月20日，23點14分，星期四IRMA與RIA的工作原理的主要區別項目RIAIRMA反應機制競爭性反應非競爭性全量反應靈敏度提高（10-100倍）反應試劑三種標記抗原二種標記抗體分離方法抗原只需一個抗原決定簇一般需單抗作分離劑，抗原需兩個或兩個以上決定簇待測抗原復合物放射性與待測抗原呈負相關與待測抗原呈正相關非特異性結合主要影響高劑量反應主要影響低劑量反應待檢抗原性質