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文檔簡介

1、治療性抗體研發的進展和關鍵技術治療性抗體研發的進展和關鍵技術主要內容治療性抗體研發概況治療性抗體研發的主要進展治療性抗體研發中要注意的問題主要內容治療性抗體研發概況治療性抗體研發的進展和關鍵技術課件治療性抗體研發的進展和關鍵技術課件基因特克: Wassim NashabehTerminologies: Aggregates, main peak, fragmentsContainer Integrity TestingDi-, tri-sulfide bond formation N, O-Glycosylation, et al, mAbs, 2010, 2 :3, 285-298.CTLA

2、-4 黑色素瘤FormulationHydrolysis (DP)Formulation抗體分子結構特點:四條肽鏈,重鏈糖基化,結構上有較多二硫鍵通過雙特異性抗體靶向效應細胞發現藥物靶標的主要方法KADCYLA (T-DM1)二聚體克隆篩選是質量控制的關鍵步驟Assays: HPSEC, CE-SDS, SDS, AUCVEGF 結腸癌 肺癌用抗體藥物治療的疾病腫瘤自身免疫病感染性疾病抗移植排斥心血管疾病骨質疏松罕見病眼黃斑變性炭疽基因特克: Wassim Nashabeh用抗體藥物治療的疾抗體結構與功能關系抗體結構與功能關系抗體藥物的作用機理直接效應 誘導凋亡 抑制增殖 阻斷生長因子或生長因

3、子受體 干擾血管生成間接效應 依賴補體的細胞毒(CDC) 依賴抗體的細胞毒(ADCC) 作為毒素、放射性同位素和細胞 毒藥物的載體 形成抗獨特型抗體 通過雙特異性抗體靶向效應細胞抗體藥物的作用機理直接效應 誘導凋亡抗體藥物在臨床應用中面臨的挑戰免疫原性殺傷靶細胞的活性弱成藥性問題新靶點抗體藥物在臨床應用中面臨的挑戰免疫原性抗體藥物研發的主要進展降低抗體的免疫原性改變抗體的效應功能提高抗體表達量引入先進的抗體表征和質控方法改進抗體規模化生產技術新靶點的發現抗體藥物研發的主要進展降低抗體的免疫原性CDR移植FR移植SDR移植表面氨基酸重塑Phage display轉基因鼠單細胞PCR人工設計抗體人

4、源化和人源抗體CDR移植Phage display抗體人源化和人源抗體人源抗體制備的主要技術EB病毒轉化人B細胞人-人雜交瘤技術抗體庫技術轉基因小鼠人工設計和合成人源抗體人源抗體制備的主要技術EB病毒轉化人B細胞抗體庫技術轉基因小鼠抗體庫技術轉基因小鼠人工設計和合成人源抗體Her2晶體結構D4SDS非還原電泳155KDaHF人源表達抗體的純化和功能鑒定HF人源抗體基因合成、構建、表達人源化抗體設計、虛擬篩選抗體專家分析系統抗原抗體復合物結構信息分析HF人源抗體對Her2+ +細胞的ADCC殺傷效應分析HFSKVO3 Her2+MCF7 - Her2+HerceptinSKVO3 Her2+MC

5、F7 - Her2+HF人源抗體對Her2靶點的特異性識別人工設計和合成人源抗體Her2晶體結構D4SDS非1986199419971998200020012002200320042006200720082009201020112012鼠源 嵌合 人源化 人源FDA批準的抗體藥物OKT3ReoProRituxanZenapaxSimulectSynagisRemicadeHerceptinEnbrelMylotargCampathZevalinHumiraXolairBexxarRaptivaAvastinErbituxTysabriLucentisVectibixSolirisCimziaA

6、ctemraStelaraSimponiIlarisArzerraNumaxProliaABThraxBenlystaYervoyPerjeta1986鼠源 嵌合 第二代抗體藥物抗TNF adalimuab (Humira,全人抗體) certolizumab(Cimzia,PEG修飾的Fab) golimumab (Simponi,全人抗體)抗CD20 ofatumumab (Arzerra, 全人抗體)抗RSV motarizumab (親和力更高)抗EGFR panitumumab (Vectibix, 全人抗體)第二代抗體藥物抗TNF adalimuab (Hum抗體效應功能的改造定點

7、突變改造Fc改變糖基化雙特異性或多特異性抗體抗體效應功能的改造定點突變改造Fc減弱抗體的效應功能Fc上進行定點突變 Teplizumab(Leu234Ala,Leu235Ala)去糖基化 Otelixizumab(去糖基化,Asn297Ala)選擇IgG4亞型或雜合亞型(IgG2/IgG4)Fc融合蛋白減弱抗體的效應功能Fc上進行定點突變提高抗體的效應功能雙特異性抗體改變抗體效應功能偶聯細胞毒物質抗體Fc突變改變抗體糖基化細胞內抗體抗體融合蛋白提高抗體的效應功能雙特異性抗體改變抗體偶聯細胞毒物質抗體Fc直接效應 誘導凋亡Terminologies: sequence polymorphism;

8、 mutation; mis-incorporation; sequence extension, insertion, deletion, and crossover.HER2 乳腺癌Basic Variants, 18%MT111,MEDI565突變Met252Tyr,Ser254Thr,Thr256Glu增加抗體的半壽期S-GlutathionylationProduct RecoveryCD30 x CD16A抗CD20 ofatumumab (Arzerra, 全人抗體)形成抗獨特型抗體Proteolytic processing (C-term)直接效應 誘導凋亡1 抗體Fc突變提

9、高效應功能突變Ser239Asp,Glu330Leu,ILe332Glu提高ADCC突變Gly236Ala,Ser239Asp,ILe332Glu提高ADCP和ADCC雜合IgG亞型提高CDC突變Met252Tyr,Ser254Thr,Thr256Glu增加抗體的半壽期1 抗體Fc突變提高效應功能突變Ser239Asp,Glu32 改變抗體Fc的糖基化2 改變抗體Fc的糖基化各種糖基化變化對抗體功能的影響來自潘海報告各種糖基化變化對抗體功能的影響來自潘海報告第三代抗體藥物抗CD20 obinutuzumab(糖基化改造,提高 ADCC) AME-133v (Fc改造,提高ADCC) TRLI-

10、05 (Fc改造,提高ADCC) Pro13192 (Fc改造,提高ADCC)抗RSV/F MEDI-557 (Fc改造,增加半壽期)第三代抗體藥物抗CD20 obinutuzumab(糖3 抗體上偶聯細胞毒物質3 抗體上偶聯細胞毒物質治療性抗體研發的進展和關鍵技術課件單抗: 癌細胞表面過量表達的抗原且能內吞。偶聯鏈: 在血液中穩定但可以在細胞內釋放毒素。毒素藥物: 需要極毒的可以抑制細胞生長的化合物賴氨酸 偶聯輕重鏈間二硫鍵偶聯定點偶聯KADCYLA (T-DM1)Genentech/ImmunogenADCETRIS (aCD33-vcMMAE)Seattle GeneticsThio-M

11、ab or Ambrxs unnatural AA incoporation抗體-藥物偶聯技術單抗: 癌細胞表面過量表達的抗原且能內吞。賴氨酸 偶聯輕重鏈FDA批準的ADC藥物放射性同位素,Bexxar, Zevalin毒素小分子藥物,Mylotarg,T-DM1 AdcetrisFDA批準的ADC藥物放射性同位素,Bexxar, Ze4 雙特異性抗體4 雙特異性抗體歐洲上市的雙特異性抗體歐洲上市的雙特異性抗體在臨床試驗的雙特異性抗體抗體名稱靶抗原臨床試驗SAR156597IL4 x IL13Phase IAFM13CD30 x CD16APhase IFBT-A05,Bi20CD20 x C

12、D3Phase IMT110EpCAM x CD3Phase IMT111,MEDI565CEA x CD3Phase IIMCgp100Gp100 x CD3Phase ITF2CEA x IMP288 haptenPhase IMEHD-7945AEGFR x HER3;dual IgG1Phase IMM-111HER2 x HER3Phase ICVX-241Ang2 x VEGF;dual IgG1Phase IIOzoralizumab ATN103TNF x albuminPhase II在臨床試驗的雙特異性抗體抗體名稱靶抗原臨床試驗SAR15655 免疫細胞因子5 免疫細胞因子

13、靶抗原選擇針對已確認過的靶 臨床確認 實驗確認尋找新的功能性靶抗原靶抗原選擇針對已確認過的靶自身免疫病的治療靶自身免疫病的治療靶上市抗腫瘤抗體藥物的靶抗原靶分子 適 應 癥CD20 NHL CLLHER2 乳腺癌 CD52 CLL EGFR 結腸癌 VEGF 結腸癌 肺癌 CD33 AML CTLA-4 黑色素瘤 CD30 淋巴瘤 上市抗腫瘤抗體藥物的靶抗原靶分子 適治療性抗體研發的進展和關鍵技術課件治療性抗體研發的進展和關鍵技術課件發現藥物靶標的主要方法分子流行病學調查人類遺傳學研究人類功能基因組學蛋白組學生物信息學藥理學模式動物發現藥物靶標的主要方法分子流行病學調查候選基因可成藥的候選藥靶

14、與疾病的相關性候選基因可成藥的候選藥靶與疾病的相關性治療性抗體研發中要注意的問題抗體分子結構特點:四條肽鏈,重鏈糖基化,結構上有較多二硫鍵L治療性抗體研發中要注意的問題抗體分子結構特點:四條肽鏈,重鏈Protein expressionSolubilitystability 抗體結構與成藥性的關系Protein expression 抗體結構與成藥性的關系Master Cell BankWorking Cell BankRaw MaterialsSmall-scale Cell CultureLarge-scale Cell CultureProduct RecoveryProduct Fil

15、trationFormulationPool BulksSterile Filter, Fill, and Partial Stopper VialsLyophilizeCap VialsLiquid ProductsProduct InspectionContainer Integrity TestingLabeled Final Vial ProductPackaging單抗體生產工藝和過程Drug Substance李鋒Drug ProductMaster Cell BankWorking Cell B從細胞表達到病人臨床注射,單抗體藥物可能發生多種反應變化細胞培養配伍制劑和儲藏分離純化

16、臨床注射和新陳代謝酶糖基化化學糖基化還原反應序列變異還原反應水解反應聚合化氧化反應異構化化學糖基化脫氨基化巰基半胱胺酸化酶降解反應理化分析和質量控制對于抗體制藥工業各個環節起著支持和指導的重要作用。如同眼睛對人的作用一樣,沒有好的分析手段和方法,抗體生產過程就可能走向歧途。 引自張伯彥報告從細胞表達到病人臨床注射,單抗體藥物可能發生多種反應變化細胞可變區: 選擇Gln為氨基末端,減少電荷變異 突變CDR區上不穩定的點 突變某些氨基酸,避免抗體聚合 去除可變區上的糖基化位點恒定區: 鉸鏈區改造避免出現半個抗體和不規則 二硫鍵或異型結構 提高與FcRn結合,增加血清半壽期影響抗體藥物穩定性和效能的

17、因素可變區:影響抗體藥物穩定性和效能的因素單抗體藥物產品是各種變異體的混合物 電荷變異體 by iCIEF 7.07.27.47.67.88.08.28.48.68.89.09.29.4Lower pI MarkerUpper pI MarkerMain Peak, 54% Acidic Variants, 28%Basic Variants, 18% 序列變異體 by Tryptic Peptide Map Clone# M83R 體積變異體 by SEC 二聚體 脫氨基化 (32)Met 氧化 (22)糖基化(22)高甘露糖化,G0, G1,G1,G2(5)唾液酸化(5)C-端Lys (2

18、)2644552=9600(9600)2 108 約1億個可能的變異體!美國FDA: Steven Kozlowski 基因特克: Wassim NashabehOODDDGGKKpyro-EODGGDODpyro-E單抗體藥物產品是各種變異體的混合物 Amidation (C-term)*Di-, tri-sulfide bond formation N, O-GlycosylationC-mannosylation (W)Proteolytic processing (C-term)Sequence Variants Oxidation (M, W, H, F, Y)S-Cysteinyl

19、ationDisulfide scramblingS-GlutathionylationThioether formationReduction Deamidation (NG,NT,NS) Isomerization (DG,DS,DD) TransaminationGlycation (K)Hydrolysis (DP)1。影響抗體質量的蛋白表達后修飾細胞內細胞外都有發生;2。質控的目標是降低或避免在生產過程中不希望看到的 PTM和序列變異發生的現象。克隆篩選是質量控制的關鍵步驟Amidation (C-term)*Oxidation (mAb Variants and Character

20、ization MethodologiesSize Variants (體積變異體)Terminologies: Aggregates, main peak, fragmentsAssays: HPSEC, CE-SDS, SDS, AUCCharge Variants (電荷變異體)Terminologies: Acidic peak, main peak, and basic peak variantsAssays: HPIEC, iCIEF, pH-IECSequence Variants (序列變異體): caused by unintended amino acid substitutionsTerminologies: sequence polymorphism; mutation; mis-incorporation; sequence

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