1、臨床生物化學檢驗常用技術第3章臨床生物化學常用技術1臨床生物化學檢驗常用技術第3章臨床生物化學常用技術1 本 章 主 要 內 容光譜檢驗技術電化學分析技術電泳技術干化學技術PCR技術 臨床生物化學常用技術2 本 章 主 要 內 容臨床生物化學常用技術2教學目標和要求 掌握光譜分析中的對比法、摩爾吸收系數法、比濁法測定的方法原理，在生化檢驗中的應用及注意事項；區帶電泳的原理、應用及影響因素；離子選擇性電極法測定的原理和注意事項。 熟悉離心技術，其它電泳技術和層析技術中的HPLC及親和層析的原理和應用；免疫分析技術、生物傳感技術的概念和應用原理。 了解色譜、層析等常用生化技術的應用原理和方法，生物

2、芯片技術的概念和應用原理。 臨床生物化學常用技術3教學目標和要求臨床生物化學常用技術3第一節 光譜分析技術分光光度技術的基本原理分光光度計的基本結構分光光度計的操作方法 分光光度技術的定性和定量方法 臨床生物化學常用技術4第一節 光譜分析技術分光光度技術的基本原理分光光度計的基光的本性光的描述：波長和能量可見光：400nm760nm紫外光:200 nm400nm紅外光: 760nm1000nm臨床生物化學常用技術5光的本性臨床生物化學常用技術5光譜分析技術原理： 利用各種化學物質都具有發射、吸收或散射光譜譜系的特征，以此來確定物質性質、結構或含量。光譜分析技術分類：發射光譜分析技術：火焰光度法

3、、原子發射光譜法和熒光光譜法 吸收光譜分析技術：紫外、可見光分光光度法，原子吸收分光光 度法和紅外光譜法 散射光譜分析技術：比濁法 臨床生物化學常用技術6光譜分析技術原理： 利用各種化學物質都具有發射、吸收或一、分光光度技術的基本原理（一）吸光度與透光度 A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I 當光線通過均勻、透明的溶液時可出現三種情況：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透過溶液。設入射光強度為I0，透射光強度為I，I和I0之比稱為透光度，即：T = I/I0 T100為T%稱為百分透光度。透光度的負對數稱為吸光度即：臨床生物化學常用技術7一、分光光度技術的基本原理（

4、一）吸光度與透光度 當（二）Lambert-Beer定律 Lambert-Beer定律是討論溶液吸光度同溶液濃度和溶液層厚度之間關系的基本定律，該定律是分光分析的理論基礎。其表達式為： A = KLC 式中A為吸光度；K為比例常數，稱為吸光系數；L為溶液層厚度，稱為光徑；C為溶液濃度 （Lambert-Beer定律適用于可見光、紫外光、紅外光和均勻非散射的液體。）臨床生物化學常用技術8（二）Lambert-Beer定律 Lambert-B吸收曲線（曲線）1.0 0.8 0.6 0.4 0.2Y=ax+b臨床生物化學常用技術9吸收曲線（曲線）吸光系數的應用、定性、判斷方法的靈敏度、定量測定物質濃

5、度臨床生物化學常用技術10吸光系數的應用、定性臨床生物化學常用技術10偏離朗伯比耳定律的因素?1、光學因素2、化學因素3、為什么有的分光光度計使用雙波長或雙光束？臨床生物化學常用技術11偏離朗伯比耳定律的因素?1、光學因素臨床生物化學常用技術11分光光度法的結構光源及光源要求波長的選擇原則:可按“吸收最大，干擾最小”的原則進行。 2、單色器3、比色杯及要求4、檢測器與顯示器臨床生物化學常用技術12分光光度法的結構光源及光源要求臨床生物化學常用技術12分光光度計的使用1、開啟電源，將比色池蓋打開，通電20分鐘預熱2、調節波長3、將空白液、標準液及樣品液置于光路4、空白調節T為0、100%5、調A

6、為06、重復4和57、測量標準和樣品吸光度。臨床生物化學常用技術13分光光度計的使用1、開啟電源，將比色池蓋打開，通電20分鐘預（二）吸光度的校正 鉻酸鉀的標準液可用于校正分光光度計的吸光度。在25，將4mg鉻酸鉀溶于100ml的0.05mol/L KOH中，放入比色池中，在不同波長下測定吸光度值，與己知的標準吸光度校正表進行比較，可檢測儀器吸光度的準確度。 臨床生物化學常用技術14（二）吸光度的校正 鉻酸鉀的標準液可用于校正分光光度計四、分光光度技術的定性和定量方法（一）分光光度技術的定性方法定性依據：最大吸收波長max和摩爾吸光系數 2.摩爾消光系數方法1.最大吸收波長max方法臨床生物化

7、學常用技術15四、分光光度技術的定性和定量方法（一）分光光度技術的定性方法（二）分光光度技術的定量方法1、對比法1、將已知濃度的標準品和待測溶液有同一方法、在相同條件下同時進行測定。2、當標準液與標本用量可能不同時的測定。標準液的要求：其濃度盡量接近于樣品濃度。（雙標準）臨床生物化學常用技術16（二）分光光度技術的定量方法1、對比法標準液的要求：其濃度盡（二）分光光度技術的定量方法2.標準曲線法 用途：1、確定分析范圍2、減少系統誤差3、比較方法的靈敏度臨床生物化學常用技術17（二）分光光度技術的定量方法2.標準曲線法臨床生物化學常用技 根據Lambert-Beer定律，液體的濃度在一定范圍內

8、與吸光度成正比關系。配制一系列濃度的標準品溶液（濃度應包含高、中、低濃度范圍），按標本處理方法作相同處理，在特定波長下測定吸光度，以標準液濃度為橫座標，以吸光度為縱座標，將對應各點連成一條通過原點的直線，這條直線稱為標準曲線。待測溶液測定吸光度后，從標準曲線上可查出其相應的濃度。方法：臨床生物化學常用技術18 根據Lambert-Beer定律，液體的濃度在一定范作圖法的步驟1、制備標準液2、顯色反應3、比色4、作圖5、制作檢量表。臨床生物化學常用技術19作圖法的步驟1、制備標準液臨床生物化學常用技術19將一系列濃度不同的標準溶液按照、一定操作過程顯色后，分別測吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫

9、坐標繪制標準曲線。從標準曲線找出相對應的待測樣品的濃度，即標準曲線法。標準曲線法臨床生物化學常用技術20將一系列濃度不同的標準溶液按照、標準曲線法臨床生物化學常用技制作和應用標準曲線時應注意下面幾點：（1）濃度范圍足夠大（2）減少偶然誤差（3）當待測液吸光度超過線性范圍時，應將標本稀釋后再測定。（4）標本測定的條件應和標準曲線制作時的條件完全一致。（5）測定條件發生變化時（如更換標準品和試劑等），應重新繪制。（6）標準品應有高的純度，標準液的配制應準確。臨床生物化學常用技術21制作和應用標準曲線時應注意下面幾點：（1）濃度范圍足夠大（2第二節電化學分析技術 電化學法概述電化學分析：利用物質的電

10、化學性質，測定化學電池的電位、電流或電量的變化進行分析的方法。主要有：電位法、電導法、電容法。臨床生物化學常用技術22第二節電化學分析技術 電化學法概述電位分析法基本原理電位分析法是利用電極電位和濃度之間關系來確定物質含量的分析方法。電極電位由能斯特方程式確立。電極電位測定是通過構建原電池電動勢，其中一個電極的電位隨待測離子嘗濃度改變而改變（指示電極）；另一電極電位不受試液影響（參比電極），通過測定原電池的電動勢便可求得待測離子濃度。臨床生物化學常用技術23電位分析法基本原理電位分析法是利用電極電位和濃度之間關系來確Nernst方程。其方程式為： R為氣體常數、T為絕對溫度、n為離子電荷數、F

11、為法拉第常數a為被測離子活度臨床生物化學常用技術24 R為氣體常數、T為絕對溫度、n為離子電荷數、F一、離子選擇電極法的原理離子選擇電極分析法（ion selective electrode，ISE）是利用電極電位和離子活度的關系來測定被測離子活度的一種電化學分析法。ISE法的核心是指示電極上帶有對被測離子選擇性響應的敏感膜，膜的一面與被測離子的溶液相接觸、另一面則與電極內所充的一定活度的被測離子溶液和內參比電極接觸，膜內外的離子活度的差異引起離子從高濃度向低濃度遷移，從而產生電位改變，其數值可在等電流的條件下測定。臨床生物化學常用技術25一、離子選擇電極法的原理離子選擇電極分析法（ion s

12、ele離子選擇性電極結構臨床生物化學常用技術26離子選擇性電極結構臨床生物化學常用技術26臨床生物化學常用技術27臨床生物化學常用技術27ISE的特點選擇性好:多數情況下共存離子的干擾小，組成復雜的試樣往往不需分離處理即可直接測定；靈敏度高：可達10-510-8mmol/L, 線性范圍寬，Na+為10-610-1mmol/L，K+為310-51mol/L，氯為510-51mol/L，Ca+為310-51mol/L；溶血、脂血及黃疸不影響測定，對有色、渾濁溶液都可進行分析；設備簡單，分析速度快，易于自動化，標本用量少，應用范圍廣。臨床生物化學常用技術28ISE的特點選擇性好:多數情況下共存離子的

13、干擾小，組成復雜離子選擇電極分析方法1、標準曲線法2、標準比較法3、標準加入法（消除基質效應）樣品測定方式：直接法與間接法臨床生物化學常用技術29離子選擇電極分析方法1、標準曲線法2、標準比較法3、三、離子選擇性電極法測定的影響因素1離子強度2、溫度3、PH值4、共存離子的干擾臨床生物化學常用技術30三、離子選擇性電極法測定的影響因素臨床生物化學常用技術30Attention! 電解質分析儀一般要求24小時開機，目的是為了保持電極膜很好的水化，增加電極的穩定性。經常關儀器，使得電極膜干燥，會加速電極膜的失效和產生測定中的漂移。儀器正常啟動后，清洗管道，進行兩點校準，每隔2小時自動單點校準。每天

14、用后進行電極保養，去除附在電極膜上的蛋白質。臨床生物化學常用技術31Attention! 電解質分析儀一般要求24小時開機，目的第三節 干化學分析技術 一、干化學分析原理 1、反射光度法Kubelka-Munk理論：光反射率與固相層的厚度、單位厚度的光吸收系數以及固相反應層的散射系數有關系，當固相層的厚度和固相反應層的散射系數固定時，光吸收系數與待測物的濃度成正比。臨床生物化學常用技術32第三節 干化學分析技術 一、干化學分析原理 臨床生物化學常干化學的原理（1）試劑結構Sample反射層清除劑層支持層 樣本擴散層試劑層臨床生物化學常用技術33干化學的原理（1）試劑結構Sample反射層清除劑

15、層支持層二、分析原理 （一）分析過程 1樣本擴散層待測樣品定量加到干片試劑，由展開層把樣品均勻展開，并且阻擋固體物質如紅細胞和大分子物質進入試劑層。2、反射層 光漫射層，為光檢測提供一個具有反射的背景。3、清除劑層：清除血清中內源性干擾物臨床生物化學常用技術34二、分析原理 （一）分析過程 臨床生物化學常用技術344試劑層樣品中的水分成為干式試劑的溶劑，試劑與待測物質進行化學反應。試劑層的結構還能控制多步化學反應的反應次序。支持層為一透明膠片，僅起支撐試劑干片的作用。臨床生物化學常用技術354試劑層樣品中的水分成為干式試劑的溶劑，試劑與待測物質進干化學的原理（3）比色樣本擴散層反射層清除劑層支

16、持層 接收器臨床生物化學常用技術36干化學的原理（3）比色樣本擴散層接收器臨床生物化學常用技術干化學分析技術的影響因素儀器監測：標準灰色試劑條/校準條校準頻度：每6個月校準一次，質控經常做質控物：用干化學分析儀生產廠家提供干片試劑的儲存與使用：0保存，平衡后用工作環境與溫度：1530，濕度85%臨床生物化學常用技術37干化學分析技術的影響因素儀器監測：標準灰色試劑條/校準條臨床第四節 電泳分析技術臨床生物化學常用技術38第四節 電泳分析技術臨床生物化學常用技術38一、電泳技術的原理及其影響因素1 原理：帶電粒子在電場中的移動現象稱為電泳(Electrophoresis)。帶負電荷的粒子向電場的

17、正極移動；帶正電荷的粒子則向負極移動。各種物質由于所帶凈電荷的種類和數量不同，因而在電場中的遷移方向和速度不同。利用物質的這種性質可以對物質進行分離和鑒定。臨床生物化學常用技術39一、電泳技術的原理及其影響因素1 原理：帶電粒子在電場中2 影響顆粒電泳遷移率的因素電泳遷移率？1、分子形狀 體積大者慢，小者快2、EvQEV擴散明顯、區帶模糊、分辨率下降臨床生物化學常用技術402 影響顆粒電泳遷移率的因素電泳遷移率？1、分子形狀 3、 緩沖液（1）緩沖溶質 性質穩定，緩沖容量大、電導低、離子移動好（2）pH 影響分子電荷性質和電量 (3)離子強度（I） 影響緩沖容量、速度和產熱效應 I、pH穩定、

18、速度慢、產熱多、時間延長、擴散 I、 pH不穩定、速度快、產熱少；區帶不整齊、分辨率 下降 臨床生物化學常用技術413、 緩沖液臨床生物化學常用技術414、支持介質 吸附作用：支持介質對標本的吸附作用 吸附作用使電泳速度減慢，出現拖尾現象。 電滲：電場中液對固相的相對移動 電滲只影響電泳速度，不影響分辨率臨床生物化學常用技術424、支持介質臨床生物化學常用技術42蒸發：支持介質水份的蒸發導致緩沖液濃縮，離子強度增加，標本分電流減少，電泳速度減慢；虹吸作用，使標本區帶向中間集中并彎曲，導致分辨率下降。（所以，電泳時電泳槽要密閉）臨床生物化學常用技術43蒸發：支持介質水份的蒸發導致緩沖液濃縮，離子

19、強度增加，標本分二、電泳類型及應用電泳的分類方法很多，在這里電泳原理將電泳分離系統分為1、移動界面電泳2、區帶電泳3、穩態電泳臨床生物化學常用技術44二、電泳類型及應用電泳的分類方法很多，在這里電泳原理將電泳分（一）. 醋酸纖維素薄膜電泳（cellulose acetate electrophoresis）醋酸纖維素是將纖維素的羥基乙酰化而形成的纖維素醋酸酯，由它制成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜。它具有分辨力好，對蛋白質吸附極少，拖尾現象輕微；不吸附染料，對區帶周圍的染料能完全洗去，不干擾測定；樣品需要量少、介質又可以透明后定量掃描等優點。臨床生物化學上分離血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、甲胎

20、蛋白及同工酶等大分子物質。臨床生物化學常用技術45（一）. 醋酸纖維素薄膜電泳（cellulose acet缺點和注意事項： 吸水性差，水份易蒸發。 電泳槽要求密閉，維持水蒸氣飽和 電流強度不宜過大，0.40.6mA/cm寬。臨床生物化學常用技術46缺點和注意事項：臨床生物化學常用技術46（三） 瓊脂糖凝膠電泳概述：瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂糖凝膠作為支持介質的一項電流技術。常用于血漿脂蛋白、免疫球蛋白、同工酶和DNA酶切片斷的電泳分離。臨床生物化學常用技術47（三） 瓊脂糖凝膠電泳概述：瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂糖凝膠作為瓊脂糖凝膠電泳優點 電滲作用小 吸附極微 分辨率和重現性均較好 適合分離大分子

21、物質（分子篩效應） 電泳圖譜清晰便于掃描并可長期保存臨床生物化學常用技術48瓊脂糖凝膠電泳優點臨床生物化學常用技術48臨床生物化學常用技術49臨床生物化學常用技術49（二）. 聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，由丙烯酰胺單體和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑和加速劑的作用下聚合而成三維網狀結構的凝膠。臨床生物化學常用技術50（二）. 聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamid常用的催化劑有過硫酸胺和核黃素，加速劑一般用四甲基乙二胺。凝膠網狀結構孔徑的大小，決定于丙烯酰胺單體的濃度和甲叉雙丙烯酰

22、胺的濃度及兩者的比例。臨床生物化學常用技術51常用的催化劑有過硫酸胺和核黃素，加速劑一般用四甲基乙二胺。臨PAGE的三種效應1、標本濃縮效應2、電荷效應3、分子篩效應臨床生物化學常用技術52PAGE的三種效應1、標本濃縮效應臨床生物化學常用技術52電泳區帶的測定方法分類：直接法：紫外光掃描區帶，適用于透明介質染色法：染料染色后，洗脫背景可見光掃描臨床生物化學常用技術53電泳區帶的測定方法分類：臨床生物化學常用技術53區帶染色法蛋白質染料：麗春紅、氨基黑10B、考馬斯亮蘭、溴酚蘭、硝酸銀。同工酶的染料：常使用乳酸脫氫酶（LDH）-輔酶（NAD+）-酚嗪甲酯硫酸鹽（PMS）-NBT脂蛋白染料：蘇丹

23、紅、蘇丹黑，油紅O核酸染料：溴乙啶臨床生物化學常用技術54區帶染色法蛋白質染料：麗春紅、氨基黑10B、考馬斯亮蘭、溴酚區帶定量分析1、光密度掃描法2、洗脫比色法 特殊電泳技術自動電泳分析臨床生物化學常用技術55區帶定量分析1、光密度掃描法 特殊電泳技術臨床生物化學常電泳的臨床應用一、蛋白質電泳血清蛋白電泳免疫固定電泳脂蛋白電泳尿蛋白電泳二、同工酶電泳分析臨床生物化學常用技術56電泳的臨床應用一、蛋白質電泳臨床生物化學常用技術56臨床生物化學常用技術57臨床生物化學常用技術57臨床生物化學常用技術58臨床生物化學常用技術58第六節自動化分析技術臨床生物化學常用技術59第六節自動化分析技術臨床生物

24、化學常用技術59教學目標和要求掌握自動生化分析儀的分析方法類型及其 特點，連續監測法的理論K值，必選的分析參數，雙波長測定的作用，雙試劑的優點，分析儀與手工法比較的優點和缺點。熟悉分立式自動生化分析儀的基本結構，備選的分析參數，測定過程的自動監測，校準方式和校準要求，影響分析儀分析速度的因素和分析儀性能指標。了解某些分析參數的特殊意義，分析儀的工作過程和操作方法，干片式分析儀的結構和分析原理，常用分析儀的分析性能。臨床生物化學常用技術60教學目標和要求臨床生物化學常用技術60三、自動化分析與手工操作的比較 （一）優點 1. 檢測速度快 2. 檢測靈敏度高 3. 檢測準確度高 4. 檢測精密度高

25、 5. 樣品和試劑用量減少 6. 其他 :能精確地控制反應時間 ;能精確 地控制反應溫度 ;能進行復雜的結果計算。 臨床生物化學常用技術61三、自動化分析與手工操作的比較 （一）優點臨床生物化學常用技（二）缺點 1. 選擇次波長較困難 2. 操作時間受限 3. 操作復雜性受限 :加試劑的次數受限制;無法做復雜的操作;選擇和改變反應溫度困難 4. 樣品量/試劑量的比例受限制 5. 不適宜做參考方法 6. 儀器維護和保養較復雜 臨床生物化學常用技術62（二）缺點 1. 選擇次波長較困難 臨床生物化學常用技術62 自動生化分析儀由電腦控制，將生化分析中的取樣(sampling)、加試劑、混勻、保溫反

26、應、檢測(detect)、結果計算、可靠性判斷、顯示和打印、以及清洗(cleaning)等步驟組合在一起自動進行操作的分析儀器。 臨床生物化學常用技術63 自動生化分析儀由電腦控制，將生化分析中的取樣(sam第二節 生化自動化分析方法一、分析方法分類（一）終點法（end assay） 被測物質在反應過程中完全被轉變為產物，到達反應終點，根據終點吸光度的大小求出被測物濃度，稱為終點法。該法稱為平衡法更為恰當。從時間-吸光度曲線來看，到達反應終點或平衡點時，吸光度將不再變化。終點法參數設置簡單，反應時間一般較長，精密度較好。 臨床生物化學常用技術64第二節 生化自動化分析方法一、分析方法分類臨床生

27、物化學常用技終點時間的確定根據時間-吸光度曲線來確定，根據被測物反應終點，結合干擾物的反應情況來確定。臨床生物化學常用技術65終點時間的確定根據時間-吸光度曲線來確定，臨床生物化學常用1一點法（終點法） 在反應到達終點，即在時間-吸光度曲線上吸光度不再改變時選擇一個終點吸光度值，用于計算結果。結果計算公式：待測物濃度CU=（待測吸光度AU試劑空白吸光度AB）KK為校準系數 適合蛋白、糖、膽固醇測定臨床生物化學常用技術661一點法（終點法） 在反應到達終點，即在時間-吸光度曲線圖4-3一點終點法反應曲線 A單試劑一點終點法 B雙試劑一點終點法臨床生物化學常用技術67圖4-3一點終點法反應曲線 A

28、單試劑一點終點法 2兩點法（two point end assay） 在反應過程中測定兩個時間點的吸光度，此兩點吸光度之差用于計算結果。 計算公式為： CU=（待測吸光度A2待測吸光度A1）K。 臨床生物化學常用技術682兩點法（two point end assay） 在反圖4-4兩點終點法反應曲線 A單試劑兩點終點法 B雙試劑兩點終點法 臨床生物化學常用技術69圖4-4兩點終點法反應曲線 A單試劑兩點終點法 該法能有效地消除溶血(hemolysis)、黃疸（icterus）和脂濁（lipo-turbid）等樣品本身光吸收造成的干擾。 圖4-5 血紅蛋白、膽紅素和脂濁的光吸收曲線 臨床生物化

29、學常用技術70 該法能有效地消除溶血(hemolysis)、黃疸（i（二）二點速率法（fixed-time assay） 指在反應過程中選擇適當兩點（此兩點既非反應初始吸光度亦非終點吸光度）測定吸光度，這兩點的吸光度差值用于結果計算。 計算公式 CU=(A2-A1)K。臨床生物化學常用技術71（二）二點速率法（fixed-time assay） 圖4-6兩點速率法反應曲線 該分析方法有助于解決某些反應的非特異性問題。 臨床生物化學常用技術72圖4-6兩點速率法反應曲線 臨床生物化學常用技（三）速率A法（continuous monitoring assay） 又稱連續監測法（rate assa

30、y），是在測定酶活性或用酶法測定代謝產物時，連續選取時間-吸光度曲線中線性期（各兩點間吸光度差值相等）的吸光度值，并以此線性期的單位吸光度變化值（A/min）計算結果。臨床生物化學常用技術73（三）速率A法（continuous monitoring圖4-7連續監測法反應曲線 A單試劑連續監測法 B雙試劑連續監測法 臨床生物化學常用技術74圖4-7連續監測法反應曲線 A單試劑連續監測法 酶促反應的線性段 1及5值偏小，而234，故A1點至A4點屬線性段 臨床生物化學常用技術75酶促反應的線性段 1及5值偏小，而234，故A連續監測法的優點 可以確定線性期并計算A/min，根據此值再準確地計算酶

31、活性，因而使自動生化分析儀在酶活性測定方面顯著地優于手工法。連續監測法也可用于測定呈線性反應的代謝物濃度，一般是某些基于酶法測定的代謝物。 酶活性（U/L） A/min理論（或校準）K值。 代謝物濃度CU=A/min校準K值。 臨床生物化學常用技術76連續監測法的優點 可以確定線性期并計算A/min1理論K值 多用于酶活性測定中，因酶活性尚無公認的校準品可用。根據酶活性的國際單位定義得出酶活性的計算公式為：酶活性 (U/L)=A/min將此式中 以K來表示，即為理論K值 可作為分析參數輸入到分析儀中。 臨床生物化學常用技術771理論K值 多用于酶活性測定中，因酶活性尚無公認的校準采用理論K值的

32、前提 應當是樣品和試劑的加量準確、比色杯光徑準確、溫度控制精確以及波長準確等。但事實上由于各型分析儀在注射器容積步進電機精度、濾光片帶寬等方面的差異，可造成樣品和試劑加量以及吸光度檢測的偏差，溫度的影響有時也非常大。 臨床生物化學常用技術78采用理論K值的前提 應當是樣品和試劑的加量準確、比色 由于摩爾吸光系數受比色杯光徑、波長等的影響，書本上或試劑廠家提供的理論摩爾吸光系數可能與實際所用分析儀所測的不同，因而有必要獲得實際的摩爾吸光系數，然后來計算理論K值。 臨床生物化學常用技術79 由于摩爾吸光系數受比色杯光徑、波長等的影響，書本上或（1）NADH（NADPH）摩爾吸光系數的測定 NADH

33、（NADPH）沒有標準純制品，而且配成溶液后穩定性又較差，不能直接用NADH 或NADPH標準液來校正儀器，須通過有NAD+(NADP+)參與的反應途徑。 臨床生物化學常用技術80（1）NADH（NADPH）摩爾吸光系數的測定 用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脫氫酶(GD)方法測定葡萄糖時，葡萄糖的消耗與NADH的生成呈等摩爾關系。葡萄糖有標準純制品。根據公式A=bC，已知比色杯光徑b和葡萄糖標準液濃度，測得葡萄糖標準管的吸光度A后便可計算出NADH（NADPH）的摩爾吸光系數為 A/bC。 臨床生物化學常用技術81用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脫氫酶(GD)方法測定葡萄糖時，測定方法 葡萄糖標準液

34、濃度為1Ommo1/L(0.01mol/L)，標準液加入量為3.5L，酶試劑加入量為335L，比色杯光徑為0.7cm，在340nm測得吸光度為0.465，則實測NADH摩爾吸光系數 = 6424，即在此臺分析儀上340nm波長處測得NADH（NADPH）的摩爾吸光系數為6424，而理論上NADH（NADPH）的為6220。 臨床生物化學常用技術82測定方法 葡萄糖標準液濃度為1Ommo1/L(0.（2）“色素原”酶促產物在405nm波長摩爾吸光系數的測定 有許多酶底物為人工合成的“色素原”底物，其本身無色，經酶作用后釋放出有色的反應產物，在405nm波長具有吸收峰。ALP底物磷酸對硝基苯酚 (

35、4-Nitrophenyl phosphate，4-NPP) 經酶作用后釋放出黃色的對硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)GGT底物-L-谷氨酰對硝基苯胺(-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或-L-谷氨酰-3-羥基-對硝基苯胺(-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)經酶作用后釋放出黃色的對硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)或對硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid， ANBA)。 臨床生物化學常用技術83（2）“色素原”酶促產物在405nm波長摩爾吸光系數的測定以對硝基苯酚的摩爾吸光系數

36、測定為例試劑： 4-NP標準儲存液(1Ommo1/L) 4-NP標準應用液(2.5mmo1/L，以0.84mol/L AMP緩沖液稀釋而成) 底物緩沖液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL緩沖液中，37,pH l0.09土0.02)。臨床生物化學常用技術84以對硝基苯酚的摩爾吸光系數測定為例試劑：臨床生物化學常用技術測定方法 4-NP標準液加入量為5L，底物緩沖液加入量為350L，波長405nm，光徑0.7cm，溫度37，測定得吸光度為A1；另用蒸餾水代替4-NP標準液，按上述方法測定其吸光度為A2，4-NP標準液吸光度A= A1- A2，若測得A為0.460，

37、則實測4-NP摩爾吸光系數18662 臨床生物化學常用技術85測定方法 4-NP標準液加入量為5L，底自動生化分析儀的校準方法1、K因素法：又稱標準化法或線性法，當物質的濃度與吸光度成正比時選用該法。原理：濃度=因素吸光度2、非線性法：又稱曲線擬合法，或稱為多點定標。臨床生物化學常用技術86自動生化分析儀的校準方法1、K因素法：又稱標準化法或線性法，校準K值注意事項 酶活性校準品經校準操作后由分析儀自動計算得出。在進行酶學測定時，如果分析條件的變化如溫度、樣品試劑加量和吸光度檢測偏差可同等程度地影響校準物和待測樣品，則使用校準品能進行補償。一般來說以使用校準K值為好，但必須有兩個先決條件：必須

38、使用配套的試劑；必須使用配套的高質量的校準品，該校準品應具有溯源性。 臨床生物化學常用技術87校準K值注意事項 酶活性校準品經校準操作后由分析儀自（四）透射比濁法(多點校準) 抗原與相應的抗體結合形成的免疫復合物，在反應液中具有一定的濁度，可由一般分光光度法進行透射比濁（transmission turbidimetry）測定，可用于某些蛋白質和藥物濃度等的測定。該法須做多點校準，再經非線性回歸，求出抗原或抗體的含量。 臨床生物化學常用技術88（四）透射比濁法(多點校準) 抗原與相應的抗體結合二、常用生化檢測項目分析方法舉例 1終點法檢測 常用的有總膽紅素（氧化法或重氮法）、結合膽紅素（氧化法

39、或重氮法）、血清總蛋白（雙縮脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、總膽汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、總膽固醇（膽固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白膽固醇（直接測定法）、鈣（偶氮砷法）、磷（紫外法）、鎂（二甲苯胺藍法）等。 臨床生物化學常用技術89二、常用生化檢測項目分析方法舉例 1終點法檢測 常2二點速率法苦味酸法測定肌酐采用此法。 臨床生物化學常用技術902二點速率法苦味酸法測定肌酐采用此法。 臨床生物化學常用3連續監測法 對于酶活性測定一般應選用連續監測法，如：丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、谷氨氨酰基轉移酶、

40、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代謝物酶法測定的項目如：脲酶偶聯法測定尿素等，也可用連續監測法。 臨床生物化學常用技術913連續監測法 對于酶活性測定一般應選用連續監測法4透射比濁法 透射比濁法可用于測定產生濁度反應的項目，多數屬免疫比濁法，載脂蛋白、免疫球蛋白、補體、抗“O”、類風濕因子，以及血清中的其他蛋白質如前白蛋白、結合珠蛋白、轉鐵蛋白等均可用此法。 臨床生物化學常用技術924透射比濁法 透射比濁法可用于測定產生濁度反應的第三節 分析參數 (analysisparameter）設置 封閉式生化分析儀：各種測定項目的分析參數大部分也已設計好，存于磁盤中，供用戶使用。開放式生化分析儀：用戶可以更改

41、這些參數。生化分析儀一般另外留一些檢測項目的空白通道，由用戶自己設定分析參數。臨床生物化學常用技術93第三節 分析參數 (analysisparame一、分析參數介紹（一）必選分析參數 1試驗名稱（test code）2方法類型（也稱反應模式）(assay mode)3反應溫度4主波長（primary wavelength） 5次波長（secondary wavelength）雙波長優點：減少噪音；減少雜散光；減少樣品本身光吸收噪音：從光源到比色杯、單色器及檢測器的整個光路系統中，均存在著隨時間發生變化的不穩定的檢測信號，即噪音。臨床生物化學常用技術94一、分析參數介紹（一）必選分析參數 1試

42、驗名稱（test6.反應方向（response direction） 7樣品量（sampling volume） 常量、減量和增量。8第一試劑量 （first reagent volume） 一般20-300l9第二試劑量（second reagent volume）同上。10總反應容量（total reacting volume） 一般180-350l，個別儀器能減少至120l。反應時間11孵育時間（incubate time）12延遲時間（delay time）臨床生物化學常用技術956.反應方向（response direction） 臨床生13分析時間 ：參數設定中最重要的一部14校準

43、液（calibrator）個數及濃度 15校準K值（calibrate coefficient）或理論K值16線性范圍（linearity range）17小數點位數（decimal point digit） 臨床生物化學常用技術9613分析時間 ：參數設定中最重要的一部臨床生物化學常用技術參數設置舉例1、某生化分析儀有關參數設置的范圍：樣品格235ul,第一和第試劑量均為20270ul 總反應體積180350ul，吸光度監測驗18s，總反應時間為10min，各試劑可加入時間：1.5min,4.5min,9.5min.2、肌酸激酶試劑盒通用參數：樣品50ul，第一試劑1000ul，37保溫5m

44、in，加第二試劑500ul，延滯時間2min，在340nm讀第一點吸光度，連續監測2min。臨床生物化學常用技術97參數設置舉例1、某生化分析儀有關參數設置的范圍：樣品格23根據以上條件進行參數設置（1）按比例減少樣品和試劑的劑量，使反應總體積在180350ul范圍內。選擇樣品質10ul，第一試劑200ul，第二試劑100ul，總體積310ul。（2）確定第二試劑加入時間：根據通用參數，應選擇4.5min為第二試劑加入點.(3)確定各個吸光度選擇點:由于第二試劑的加入點是4.5min,換算成監測周期為第1617之間,加上延滯時間2min,則在第24監測點為第一點吸光度,并連續監測量2431監測

45、點.臨床生物化學常用技術98根據以上條件進行參數設置（1）按比例減少樣品和試劑的劑量，使計算K值:根據樣品量度10ul,第一試劑200ul,第二試劑100ul代入計算公式,則 K=也可以采用肌酸激酶的校準品,執行校準程序來得到校準方程:K=校準品濃度/校準品吸光度臨床生物化學常用技術99計算K值:根據樣品量度10ul,第一試劑200ul,第二試劑第四節自動生化分析儀 工作過程和操作方法 一、工作過程 在測定過程中所有機械步驟均由微處理器根據已設定的程序（procedure）進行工作。臨床生物化學常用技術100第四節自動生化分析儀 工作過程和操作方法 一、工1取樣加試劑和混勻2保溫反應和吸光度檢

46、測3計算并顯示或打印結果臨床生物化學常用技術1011取樣加試劑和混勻2保溫反應和吸光度檢測3計算并顯示或二、操作方法 （一）操作前的各項檢查（1）正常開機以后，檢查沖洗用水裝置是否正常、各項分析試劑是否充足、各種清洗劑是否足夠，以及樣品針、試劑針和攪拌棒是否清潔。（2）確認要進行校準的項目，確認要做的質控批號及項目，以及校準品、質控品是否足夠。（3）進行光度計自檢來確認光路與檢測系統是否處于正常工作狀態。 臨床生物化學常用技術102二、操作方法 （一）操作前的各項檢查臨床生物化學常用技術10（二）校準 分析儀在樣品分析之前都要對該分析項目進行校準（也稱定標），得出一個該項目的校準系數（K）。校

47、準前首先必須在反應程序里設定有關校準的參數，如校準液的代碼、位置及濃度值等。執行校準程序，檢測得到該校準品的吸光度值，再根據校準濃度計算校準系數（K=校準品濃度/校準品吸光度）。 臨床生物化學常用技術103（二）校準 分析儀在樣品分析之前都要對該分析項目1校準方式 有單點校準、兩點校準和多點校準單點校準：校準曲線呈直線且通過原點，用單個濃度的校準液即可，兩點校準：若校準曲線呈直線但不通過原點，則需用兩個濃度的校準液做兩點校準；多點校準：當校準曲線不呈直線而為真正的曲線時，應做多點校準，并按其線形選擇不同的曲線方程進行擬和，如雙曲線、拋物線、冪函數、指數函數、對數函數等方程等。 臨床生物化學常用

48、技術1041校準方式 有單點校準、兩點校準和多點校準臨床生物化學如有下列情況發生時，必須進行校準： 改變試劑的種類或批號； 儀器或者檢驗系統進行一次大的預防性維護 或者更換了重要部件； 質控反映出異常的趨勢或偏移，或者超出了 實驗室規定的接受限。 臨床生物化學常用技術105如有下列情況發生時，必須進行校準：臨床生物化學常用技術105（三）質控品測定 質控是保證檢測結果可靠性的一個重要手段，因此每批樣品的分析測定均應該有質控樣品同時監測。關于分析儀的批測定，是指一批樣品從開始測定到完成測定后停止的整個過程。其中如果進行了添加或更新試劑、進行了有可能改變吸光度的維護等操作，均應進行一次質控樣品的檢

49、測，以便及時監測到分析系統的改變。 臨床生物化學常用技術106（三）質控品測定 質控是保證檢測結果可靠性的一個重要 所有分析儀都已設定或固化了有關質控的分析程序：設定有關質控參數，如每個質控品的批號、靶值和標準差；選擇質控圖的方式，如均值標準差質控圖；質控結果的統計分析，分析儀會保存每次測定的質控結果，并對其進行統計，以列表及質控圖的形式在屏幕上顯示。臨床生物化學常用技術107 所有分析儀都已設定或固化了有關質控的分析程序： 可根據質控結果在質控圖上的位置判斷其是否在控。如果判為失控則應從試劑、質控品、校準品和分析儀等幾方面尋找原因。通過對質控結果的分析，可以了解某項目的分析精密度和準確度的改

50、變。臨床生物化學常用技術108 可根據質控結果在質控圖上的位置判斷其是否在控。如果（四）檢測項目的輸入與測定 1項目輸入（1）逐項輸入：每份樣品可以任選分析儀中已設置的且試劑室內已預置試劑的項目中的一項、幾項或全部項目。臨床生物化學常用技術109（四）檢測項目的輸入與測定 1項目輸入臨床生物化學常用技術（2）項目組合輸入：把與疾病相關的檢驗項目 組合在一起，進行組合檢驗，這有利于方便病人，有利于疾病的診斷和預后分析，同時也簡化了分析操作，提高分析效率。（3）批量輸入：對于有連續相同測定項目的樣品，可使用批量輸入的方法。 臨床生物化學常用技術110（2）項目組合輸入：把與疾病相關的檢驗項目臨床生

51、物化學常用技 多數全自動分析儀的操作非常方便，在開始測定畫面，輸入該批第一個樣品的樣品號，分析儀即會自動逐個地對樣品進行測定。一般在開始畫面還可選擇： 是否需要對結果超過設定的線性范圍、超過允許的吸光度上限等的樣品自動進行重復測定； 測定結果是否需要按照已設定的打印格式自動打印與測定結果有關的選項。 2進行測定臨床生物化學常用技術111 多數全自動分析儀的操作非常方便，在開始測定畫面，輸入3急診檢驗 幾乎所有全自動生化分析儀都具備“急診優先”的功能，儀器留有急診樣品的分析位置或專用樣品架以或急診分析的專用編號。一旦在急診樣品位置上放置了樣品，并設定了急診檢驗的項目，分析儀就會在常規樣品的測定過

52、程中，優先安排對該樣品進行分析測定。 臨床生物化學常用技術1123急診檢驗 幾乎所有全自動生化分析儀都具備“急診優先”四 自動生化分析儀性能評價1自動化程度2、分析效率3、應用范圍4、分析的準確度臨床生物化學常用技術113四 自動生化分析儀性能評價1自動化程度臨床生物化學常用技二、分析儀性能指標 （一）準確度吸樣、加試劑、溫控準確度，以及光路系統如波長、檢測器準確度和波譜帶寬等，都影響檢測準確度，這些因素往往使相同項目的檢測結果向同一方向偏離。有關這些準確度的指標通常無具體說明，但可以通過相應的實驗來檢測。應當說多數分析儀對有關這些部件的制作及其工作的準確度比手工操作及其所用的儀器好得多。 臨

53、床生物化學常用技術114二、分析儀性能指標 （一）準確度臨床生物化學常用技術114（二）精密度以上影響準確度的因素同樣可因其制作不精而使工作穩定性較差，造成精密度不佳，吸樣精度以及樣品針、試劑針、攪拌棒、反應杯的交叉污染是影響精密度的主要因素，有關分析儀的資料中通常會介紹防止和減少交叉污染的措施，主要是其沖洗系統各有特點，沖洗效果可能不同。 臨床生物化學常用技術115（二）精密度臨床生物化學常用技術115（三）檢測能力 1檢測方法多數分析儀能做終點法、固定時間法、連續監測法和透射比濁法。 2檢測時間分析儀通常可檢測最長10min的反應，個別最長能檢測15-22min甚至更長。 3. 加試劑次數

54、能加1-4種試劑，多數為2種。 臨床生物化學常用技術116（三）檢測能力臨床生物化學常用技術1164. 檢測范圍 能檢測吸光度的最高值及其準確度決定檢測上限；檢測靈敏度則為能辨別待測物最小濃度差的能力，有時與最低檢出濃度一致，但后者主要取決于方法靈敏度。臨床生物化學常用技術1174. 檢測范圍臨床生物化學常用技術117（四）速度影響分析速度的因素，包括本節一中所述的試劑瓶數、取樣周期、反應杯數量、一次可容納樣品數量、試劑瓶容量和模塊組合能力等。（五）檢測成本反應杯類型和壽命決定其耗費，最小樣品量影響試劑用量，最小反應杯液量可決定樣品和試劑用量，以及保養維護消耗。臨床生物化學常用技術118（四）

55、速度臨床生物化學常用技術118第五節、其他檢驗技術自學為主臨床生物化學常用技術119第五節、其他檢驗技術自學為主臨床生物化學常用技術119四、干化學式自動生物化學分析儀 多采用以Kubelka-Munk理論為主要理論基礎的多層薄膜的固相試劑技術，僅需將樣品加在固相試劑上進行測定。它不同于大家所熟知的在反應容器中加入液態試劑和樣品,混合后發生物化學學反應的“濕化學”(wet chemistry), 所以“干化學”是相對于經典的“濕化學”而言。 干化學式分析儀是80年代問世的，其采用干化學（dry chemistry）方法，將發生在液相反應物中的反應，轉移到一個固相載體上，利用分光檢測系統進行檢測

56、的一類新型儀器。（一）工作原理臨床生物化學常用技術120四、干化學式自動生物化學分析儀 多采用優點：它完全脫離了傳統的采用試管和吸管的分析方法，儀器操作簡便，測定速度快，靈敏度和準確度與典型的分立式儀器相近。 原理分類：干化學分析儀大都采用反射光度法(reflectance spectroscopy)和基于離子選擇電極(ion selective electrode，ISE)的差示電位法(differential potentiometry)及近幾年出現有采用熒光光度計的干化學分析儀。臨床生物化學常用技術121優點：它完全脫離了傳統的采用試管和吸管的分析方法，儀器操作簡（二）儀器的類型及特點一

57、種是使用試條的反射光度法系統（reflotron system）；另一種是采用膠片涂層技術的化學分析系統（vitros chemistry system）， 采用的是干試劑包進行臨床化學分析，常稱為袋式分析儀。 臨床生物化學常用技術122（二）儀器的類型及特點一種是使用試條的反射光度法系統（ref1反射光度法系統 ：每一個檢測項目都有各自專用的試劑條，由3個主要部分組成， 密碼磁帶：位于劑試條背面,是該項目的全部檢測程序,存貯了全部方法學所必需的資料,包括:英文縮寫符號、測試范圍、血漿分離時間、波長選擇、反應時間、換算因數和誤差自檢等,插入后即傳送給微機。血漿分離區：位于正面下部并標以紅色,由

58、玻璃纖維和紙層構成。反應區：位于試劑條的正面上部。試劑條日常貯存在密封的盒內,每條的表面貼有一層錫箔,使用時再揭去。臨床生物化學常用技術1231反射光度法系統 ：每一個檢測項目都有各自專用的試劑條，由血漿運輸層試劑層反應層密碼磁帶血漿分離區輔助試劑層外膜層干試條的組成臨床生物化學常用技術124血漿運輸層試劑層反應層密碼磁帶血漿分離區輔助試劑層外膜層干試測定過程首先定量指尖肝素化毛細血管血或任何部位的穿刺血標本加在紅色的血漿分離區上。首先通過玻璃纖維層，紅、白細胞被阻截，血漿被過濾到血漿分離區，另有輔助試劑層，當血漿層中的血漿溶解滲透輔助試劑層后，通過轉移介質層將血漿運送到反應區的底部。此時儀器

59、給反應區施加400Pa的壓力，此時，試劑層2、試劑層1和透明片相繼平貼于轉移介質層(亦稱血漿池)之上。血漿中的待測物與干試劑相作用而呈色并顯示檢測結果，全部過程均在接受密碼信號后的微機控制下完成。臨床生物化學常用技術125測定過程首先定量指尖肝素化毛細血管血或任何部位的穿刺血標本加2膠片涂層技術的化學分析系統該干式化學系統使用的是試劑片（塊），它采用的是膠片涂層技術,各種反應都在干片(多層膜片)內進行。 工作原理：應用涂層技術制作膠片基礎的感光乳劑，將其均勻呈層狀地涂布在支持層或下層上。在該干片中多涂層被置于一張透明聚酯片基上,然后夾在一個塑料殼中間，共有4個功能層：即分布層，接受樣品；兩個中介層，以改變樣品的物理化學性質；一個指示劑層,對待測物進行定量。其層數視所采用的分析方法而定，干片的大小與一枚郵票大致相同，指示劑層呈現的顏色深淺隨待測物的濃度變化而變化。臨床生物化學常用技術1262膠片涂層技術的化學分析系統該干式化